※ 引述《keiny (lav dolce vita(分生所))》之銘言： : Q1: 有大大做過這個實驗嗎? : 我想請教其中的細節 : Q2: 還是有其他更適合的方法 : (看unmodified form proetin 之 expression 情形) : {前情概要} : 小弟正在做這個實驗(In vitro transcription & translation)中 : http://www.promega.com/pnotes/60/6079_07/promega.html : 目的: 要看在很少modification的環境下 : 我的protein的表現情形 : (註) 我是用S35-Met label 的 : 我要表現的DNA (約1800bp) construct在pet15b的vector中 : 因為它有T7 promoter : 手邊又剛好有 : http://www.genomex.com/vector_maps/pet15bm.pdf : {慘狀} : 不過我照著protocol做了幾次 壓了幾次片子 : 都沒有看到我想看的protein !! : 只有一些background band(compare with control:沒有放入任何DNA的Reaction !!) : 懇請諸君給予建議 : 感激不盡~~~~ Q1: 我之前用過 Promega TNT Quick coupled transcription/Translation systems 做過(不知你用哪個,不過原理應該差不多 ),也是透過T7 promoter, 用35S-Met labeled,效果還不錯. 沒有得到你要的 protein 其實要 debug 的地方還蠻多的. 以上敘 Kit 為例: a. 如前人所提的, Kit 是否有問題, 應該先用 Kit 附的 control plasmid 做看看. b. Kit 是否保存於 -70 度, 因為 Kit 中附的 master mix 對 CO2 sensitive, 所以不要用乾冰保存. c. Kit 中附的 master mix 是否有重覆解凍過, 建議不要重覆解凍, 用不完就丟了. d. 你的 DNA 中要有 start codon 及 stop codon. e. DNA template 的量是否適當, 建議 1 ug (0.2~2 ug 也可),太多太少都不好. f. 避免 RNase contamination, 應以操作 RNA 的方式進行 (RNase-free). g. Master mix 用手溫快速解凍, 再置於冰上使用. h. 反應的溫度是否保持在 30 度, 太高太低都會影響反應. i. 可提高 Mg2+ or K+ 濃度, 增加反應的效率,如加 1~3 ul Kit 所附的 T7 PCR enhancer. j. 避免 Reaction 中有 Ca2+, 因 Ca2+ 會活化一些 nuclease, 造成 DNA template or mRNA degradation. k. DNA template 中若有 EtOH 殘留會抑制 translation. Q2: 其實這方法是 In vitro 的, 對於你要看 unmodified protein expression 的實驗目的似乎不太恰當,protein expression 受很多因素影響, 表現多表 現少都是 artificial 的 (而且你用的是 T7 promoter,而非原 gene 上的 promoter), 另外,我猜你指的 modification 應該是 post-transcription modification 吧, 若是 post-translation modification 應該跟此 protein 的 expression 較沒有關係吧. 至於其他的實驗方法我就不清楚了, 不過 我也很想知道, 希望有其他專家來教教我們. --

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