※ 引述《inspire0311 (每一天都值得慶祝)》之銘言： : 我已經做western blotting一個月了， : 結果一直出現這樣的雜線? : 我問了學長，結果說我沒有用TBS洗乾淨， : 我自覺已經洗得很乾淨了。 : 為何還是這樣?請幫我看一下。 : 謝謝。 : 照片在這裡: : http://www.wretch.cc/album/show.php?i=inspire0311&b=4&f=1902925055&p=0 首先請問你做的流程? 是曾經做過正常的western blotting 或一直都長這個樣子? 我看了你的圖 感覺是SDS PAGE 本身就沒有跑好 你的蛋白很明顯沒有夠清晰的分開。 雖然你的marker是有分開的， 但marker中的蛋白本來就單純， 他有分開不代表PAGE本身的分離度是好的； 包括樣品處理是不是ok，以及膠本身是不是ok 1.檢查一下sample處理的過程中有沒有問題。 加熱時間夠不夠，溫度有沒有到， sample buffer要不要重配等。 我覺得你應該拿一些其他的來跑看看 隨便收點細胞lysate來，看actin就可以了。 同時可以一起跑一點BSA(10-100ng即可)， 當做單一蛋白在你的樣品處理方式下的參考。 首先要確認你整個實驗方法是OK的， 再來看看是不是sample本身的問題。 2.PAGE本身凝結的不好，甚至Acrylamide生成就不是平均的網狀架構 所以跑的都會歪歪的， 也有些蛋白會順著做不好的地方一路殘留， 產生你所謂縱向的線。 可以檢查一下配方,同樣的配方別人跑OK嗎? 同樣的配膠溶液人家跑OK嗎? 凝膠時間是不是過長或過短? APS是否新鮮? Tris的ph值是否正確? 做一片好膠是很重要的。 3.跑電泳的時候是否溫度過高? 電流值會不會過大?有沒有可能因為過熱而degrade? (不過感覺不太像) 4.你的sample中有什麼東西濃度很高嗎? 在約40 kDa的地方有很明顯的蛋白痕跡 而底下又有藍色的呈色 不知那個位置是你的樣品大小的地方嗎 或其實可能是因為我上面說的40 kDa蛋白過多造成的non-specific binding 可能要判讀一下訊號的真偽 因為我都是壓片，沒有做過直接膜上呈色， 這部分訊號的判讀可能要請高手幫忙解答^^ 5.抗體本身是不是一隻夠好的抗體? 在你圖中各處都有細小的點， 我認為那都是抗體的non-specific binding。 這跟你在做一抗的hybridize條件， 二抗的hybridize條件， 還有你wash的程度都有關係。 每隻抗體的能力也不同,所以有可能要去測試找出最佳的用法。 包括titer、包括反應溫度、包括時間； 有的抗體就是非四度 overnight不行， 有的抗體就是需要較高的tween 20來洗。 另,你是用TBS來洗 還是TBST洗? 既然叫做洗，就要有清潔劑喔。(不好笑，逃~) 加油囉! 其實滿多地方可以抓抓看有沒有問題的 祝你實驗順利:D --

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