作者Ezc (買東西不能對店家太客氣!)
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標題[問題] 關於QIAGEN RNeasy kit抽tissue sample的問題
時間Thu Jan 11 01:57:47 2007
這問題困擾了小弟許久 不過到目前想破頭仍然不知是為何
所以上來請教各位先進
最近得到了幾組臨床的tumor及鄰近normal sample，並使用QIAGEN RNeasy kit
抽RNA來跑RT-PCR，不過發生了一個奇怪的問題，就是抽了四組，每一組的
tumor抽出來都是260/280於2.0~2.1，260/230於2.0以上，品質應該還不錯
，跑RT-PCR也都很亮，但是每組抽Normal時，全部都抽不出來，用的
方法當然與抽tumor時一樣的，神奇的是測OD時260及280全部是0.000…
因此想了幾個原因
1 sample的RNA被degrade掉了：
每組都是normal及tumor同時處理，要degrade應該兩個都抽不出來啊…?
2 tissue磨的不夠碎：
已經盡全力磨碎了，但是就是tumor抽的好，normal抽不到
3 normal sample有問題：
應該不太可能四組都是normal有問題…?
4 抽的過程出問題：
不過已經完全遵照QIAGEN手冊上一步一步做加上考慮Trouble shooting的最好做法
一樣tumor好normal不好
其他有想過但覺得不太可能的原因
1 RNeasy kit放太久(四年以上)
membrane變質造成抽不出來，但是應該不會運氣這麼好每次都是tumor用到好的…
2 normal含血造成RNA degrade
這個原因是唯一每組抽RNA時的共通點了，因為經由RLT lysis buffer+研磨棒+針筒
均質後，都是normal的均質液較紅，而tumor較白，不過感覺有點沒道理orz
另外用Trizol抽竟然也有相似的結果，normal sample的RNA抽是抽的出來，品質就是沒有
tumor用trizol抽的好
(同重量normal 260/280~1.9，260/230~0.9 約3μg，tumor 260/280~2.0，
260/230~2.0 約30μg 差了十倍多orz)
希望有經驗的先進能夠指點一下 謝謝!!
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◆ From: 203.73.12.168
1F：推 OurNeverland:我以前也有碰到類似的情況 我覺得買新的kit吧 01/11 05:29
2F：推 asthma:有抽過clinical tumor tissue 都會遇到一樣的問題 01/11 19:47
3F：→ asthma:不是reagent的關係 我好奇的是 實驗室有經驗的人應該告訴 01/11 19:48
4F：推 ginana:感覺像是SAMPLE本身的問題，確定sample是相同保存條件嗎？ 01/12 09:56
5F：推 Ezc:保存條件都一樣…都是取出後放RNAlater先4度一天再-80度保存 01/13 18:26