※ 引述《ssuny (Cheer up!!!)》之銘言： : 從事現在在clone的蛋白已經快2個月了... : 一直沒有好的結果...本人做到都快沒信心了 : 請各位版友好心幫個忙吧...幫我看看到底是哪裡的問題... : 以下是實驗步驟及結果 請問你純化出來dna的體積是多少，你又load了多少體積的DNA? 1:5的比例我覺得是錯的，因為從你的圖看起來，insert跟vector的亮度差不多，但是 要記得，越大的fragment抓到的EtBr會越多，所以雖然看起來亮度差不多，dna的量其實 差很多。你應該要將亮度的比例除以分子量的比例。 舉例來說，你的兩個band看起來是1:1的亮度(insert:vector)分子量的比例，大約是 500:5000=1:10。這樣一除，莫耳數比就大約等於1:0.1=10:1，也就是說，在相同體積 裡面，insert的莫耳數是vector的10倍。所以，如果你要調到5:1(i:v)的話，取得體積比 應該是1:2 (i:v)。 所以你5:1(i:v)的比例是錯的。你這樣取，試管中實際的莫耳數比是50:1 (i:v)。 在這種情形下，過多的insert會與vector結合，這會造成一個vector與兩個insert 結合，也就是說，用A enzyme切過的那端抓了一個insert，用B enzyme切過的那端也抓了 另一個insert，然後兩個insert的另一端分別是A與B enzyme的切位，自然就接不起來。 在這種情形下，你挑到的菌應該就是隨機亂接或是rearrangement的結果。看你只挑 了四顆，是不是因為只有長四顆呢？ 最後，看你的insert與vector大小的比例，1:5太多了，大概1:3就差不多了。1:5我記得 是當你的insert與vector大小差不多的時候才需要用到。 試試看吧，如果你原本就有除過分子量才去做ligation的話，就當我沒說過囉～ --

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