※ 引述《ssuny (Cheer up!!!)》之銘言： : 從事現在在clone的蛋白已經快2個月了... : 一直沒有好的結果...本人做到都快沒信心了 : 請各位版友好心幫個忙吧...幫我看看到底是哪裡的問題... : 以下是實驗步驟及結果 我特別去查了一下pET32a plasmid map..... 我發現到一件事.....你可能要換restriction enzyme才能做出來..... 原因如下..... 在pET32a map上...Hind III的位置在第173bp而Sal I的位置在第179bp map上的序列如下: Sal I ------ ------------AAGCTTGTCGAC---------- ------ Hind III 你說你pET32a是用Hind III + Sal I cut 在此幫你建立一個觀念.....鄰近的兩個enzyme最好不要一起用 因為當你其中一個enzyme作用時會導致另外一個enzyme無法作用 舉例來說: 假設Hind III先作用 作用完後linear plasmid會變成以下情形 Sal I ------ -----A AGCTTGTCGAC-------- -----TTCA ACAGCTG-------- 之後,當Sal I準備要作用時, 請你注意一下 在Sal I cut site的左邊(5'端)只剩下一個base pair 這種情形大多會影響下一個enzyme的作用力....嚴重的話會讓他無法作用.... 所以, 你說你pET32a是用Hind III + Sal I cut...... 實際上, 卻只是pET32a用Hind III or Sal I cut...... 你的clone一定會做不出來............ 你試著換另一種enzyme....兩個enzyme距離遠一點(至少要離3~6 base pair以上) 不同的enzyme所需要的距離也不同, 如何查到這種資訊? 你可以去翻NEB給的catalog...... 在最後的附錄地方..給了很多restriction enzyme的information.... 包括在primer上加restriction enzyme旁邊需要留多少base pair作用效果才會好... oligo-DNA上(例如linear plasmid)旁邊要留多少base pair作用效果才會好... 等等...... 這些資訊都可以查的到....... ENB catalog是一本不錯的工具書(對常做sub-cloning的人而言).... 對於你的問題....我相信你只要將其中一個enzyme換掉...應該就可以解決.... 希望你順利.... Best..... --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.228.183