作者ssuny (Cheer up!!!)
看板Biotech
標題[求救] cloning求救...一直做到怪東西阿
時間Wed Dec 27 20:18:30 2006
從事現在在clone的蛋白已經快2個月了...
一直沒有好的結果...本人做到都快沒信心了
請各位版友好心幫個忙吧...幫我看看到底是哪裡的問題...
以下是實驗步驟及結果
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1. 將pET32a以RE切開 並將目標基因從pCRII上切下
使用的RE為 Sal I 以及 Hind III
電泳圖:
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=suny&b=8&f=1868850536&p=0
最左邊為marker, lane 1是切過的pET32a(5.9k), lane 2是切過的目標基因(~0.6k)
2. 切膠回收
電泳圖:
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=suny&b=8&f=1868850537&p=1
依序為marker,pET32a,targer gene
3. Ligation , 比例約為1:5
4. 抽plasmid以RE處理確認
分別以 Sal I 及 Hind III 處理, 可是跑完電泳後卻是怪東西
電泳圖:
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=suny&b=8&f=1868850538&p=2
如圖,4個sample切下來完全看不出來是pET32a,大小片段完全不對
看起來也不像是污染...Orz...
拜託大家給個建議吧...在這樣下去小弟真的要換題目了 囧
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.208.29
1F：推 ROKEE:妳的電泳圖沒標marker，怎麼看= = 12/27 20:35
2F：推 ssuny:唔..那我改一下好了...囧rz 12/27 23:14
※ 編輯: ssuny 來自: 211.72.204.94 (12/27 23:54)
3F：推 cyken:ligation的vector 放多少 (ng) ? 大概長多少colony ? 12/28 00:20
4F：→ cyken:有沒有 control組？ 不是埋頭苦幹兩個月就一定會成功， 12/28 00:22
5F：→ cyken:試著在每個步驟盡可能做positive and negative control 12/28 00:26
6F：→ cyken:這樣才能找出問題所在。 12/28 00:28
7F：推 johnny853884:推樓上說的~~最近深深體會 12/28 11:23
8F：推 turtle24:原po要記得load個沒切過的原vector & 切過的空vector 12/28 16:48