※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之銘言： : ※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言： : : 是的,real-time PCR的產物大小是要限制在250 bp以下的 : : 這個在設計primer的primer express軟體裡面已經內建好了限制 : : 當然也有得改啦,不過有人做過超過300 bp以上的反應就已經不太好了 : : 所以我的產物大小都控制在100-200 bp : : 嗯! 我所說的操作問題是指在轉cDNA時候的細節之類的 : : 不是說real-time的操作,因為上機實在沒有什麼可以影響的了 : 我的檢體有兩部分,一種病人,一種正常人,..起初是認為怕抽不太夠... : 我現在正常人用invtrogen的kit去抽,回溶30ul,30ul全部轉,轉的總體積約100ul : 而病人用微晶出的pre-roche(好像有拼錯..哈)的kit去抽,回溶100ul, : 分三管去轉,每管加30ul的RNA,每館總體積都約100ul : : 你用多少RNA下去轉cDNA? 然後應該有稀釋5倍吧!.. : cDNA後來沒有稀釋5倍..但後來用正常人的cDNA有稀釋10倍和100倍 : 但都做不出來 : : 你的real-time PCR用了多少這樣的cDNA去做呢?(有時下太多也會有問題喔 : )cDNA,無論是稀釋10倍會100倍都只加1ul,反應的總體機是10ul : : internal control是什麼? b-actin Ct又是多少? 40上來.等於沒有 : : 因為你是用kit抽的,基本上如過連這些資訊得到的資料都沒有問題的話 : : 我想真的有點難救... : 我目前還沒拿病人的cDNA來做...real-time : 我猜可能RNA農度太高了,但我pcr還是做的出來阿!! : 因為起出是怕說太稀了!! : 不然就是你說的...primer要做的size超過200吧..導致不好做 : 謝謝 不客氣,大家一起討論求進步嘍~~ PCR需求比real-time PCR寬鬆很多, 請不要以為"PCR做的出來就一定沒問題"比較好喔! 雖然說你的RT是東湊西湊kit做出來的 我想 你的RNA轉cDNA這一步非常的奇怪喔! 你有測過RNA得OD260/280嗎? 一般都是用1-2ug去轉cDNA,反應最後體積是20ul 然後再加DEPC-H2O到100ul(就是我所說的5倍稀釋.看來你跟我說的是一樣的) 你這樣轉cDNA實在是太浪費RNA了啦! 不管你加了多少,reverse transcriptase按照protocol來能轉的RNA就是1-2ug 多加只是浪費 我的template也是病人的血球細胞,3ml的全血抽出來的RNA就可以讓我做好多次RT 再加上你說的internal control Ct也在40左右 (amplification curve一點都沒有上升的趨勢吧) 我認為是你下的template太稀了(但是10倍應該也只差3點多個cycle,100倍應該是差7) 然後再加上你的產物如果又大於200bp,你到底做多大呢?? (不過,連b-actin都大於200 bp嗎?) 大概就是它不容易做出來的原因了 --

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