※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言： : ※ 引述《lakerjackt (N￾N )》之銘言： : : ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ : : 請問一下...你說的這限制是針對於real-time嗎? : 是的,real-time PCR的產物大小是要限制在250 bp以下的 : 這個在設計primer的primer express軟體裡面已經內建好了限制 : 當然也有得改啦,不過有人做過超過300 bp以上的反應就已經不太好了 : 所以我的產物大小都控制在100-200 bp : : 其實用kit抽,是怎麼抽都抽的出RNA....問題我想就如我那時ABI : : 跟我說出在轉cDNA,因為RT我並是用kit,而是各家廠商東奏西奏去轉的... : : 其實,我覺得不是操作的問題....操作的基本手則大家應該都一樣, : : 感覺問題不大... : 嗯! 我所說的操作問題是指在轉cDNA時候的細節之類的 : 不是說real-time的操作,因為上機實在沒有什麼可以影響的了 : : 其實我現在比較想知道,若是cDNA沒轉好,導致PCR做的出來而q-PCR做不出來.. : : 除了重抽外,有啥補救措施....拜託各位高手(因為我的檢體不太可能再重抽了..><) 我的檢體有兩部分,一種病人,一種正常人,..起初是認為怕抽不太夠... 我現在正常人用invtrogen的kit去抽,回溶30ul,30ul全部轉,轉的總體積約100ul 而病人用微晶出的pre-roche(好像有拼錯..哈)的kit去抽,回溶100ul, 分三管去轉,每管加30ul的RNA,每館總體積都約100ul : 你用多少RNA下去轉cDNA? 然後應該有稀釋5倍吧!.. cDNA後來沒有稀釋5倍..但後來用正常人的cDNA有稀釋10倍和100倍 但都做不出來 : 你的real-time PCR用了多少這樣的cDNA去做呢?(有時下太多也會有問題喔 )cDNA,無論是稀釋10倍會100倍都只加1ul,反應的總體機是10ul : internal control是什麼? b-actin Ct又是多少? 40上來.等於沒有 : 因為你是用kit抽的,基本上如過連這些資訊得到的資料都沒有問題的話 : 我想真的有點難救... 我目前還沒拿病人的cDNA來做...real-time 我猜可能RNA農度太高了,但我pcr還是做的出來阿!! 因為起出是怕說太稀了!! 不然就是你說的...primer要做的size超過200吧..導致不好做 謝謝 --

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