※ 引述《rpr (Cathy)》之銘言： : ※ 引述《bloodgas (奶油ˊ的夢)》之銘言： : PCR有一個重要的公式 : y=(1+e)^n e是PCR反應的效率,而n次方指的就是cycle number : 就我所知real-time PCR,是希望每一個PCR反應能盡量達到 e=100% : 所以才會限制產物大小 (<250 bp) 跟反應溫度(2-step PCR) ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 請問一下...你說的這限制是針對於real-time嗎? : 當然對於template的要求也是非常的高 : 如果你的template quliate不佳,做出來的結果常常會認你吐血 : (我在做基因定量,range只有1-4 copies,但是Ct差個1結果就差兩倍,真的會吐血 : 觀察國外這方面做的好的實驗室,對於template的quality要求是嚴格到不行) : 如果你都按照他的限制下去做,基本上他們是可以保證一定可以得到很好的結果 : 但是溫度是絕對可以調整的 : 如果你的基因在3-step PCR做的2-step PCR還好,當然沒有理由不調整溫度 : (這又牽涉到primer的設計,所以他們也出了一套軟體專門幫你設計適合的primer) : 只是你要確定這樣條件下的e比他們條件下的e來的好 : 另外,反應體積也是要盡量精確,因為reagent裡還有ROX dye, : 機器會在判讀時拿這個螢光作為不同well之間體積的校正 : (但是怎麼校正我就不清楚了,有興趣者可以自行測試,再來跟大家分享嗎?) : 不過一我的經驗,差個1-2 micro-liter是影響不了多少啦!(我做25 micro-liter的) : RT Real-time我也做過,用的是TRIzol抽的 : OD 260/280實在不怎麼好(說來慚愧,1.6我就歡天喜地了) : 但是也都做的出來 : 剛開始還傻傻的買他的one-step RT-PCR reagent(貴到爆) : 後來也開是自己轉(我用過BD以及invitrogen的kit) : 但是結果仍然滿意,所以抽RNA跟RT的kit應該是影響不大 : 反而是你操作的好不好的問題 ....................................... 其實用kit抽,是怎麼抽都抽的出RNA....問題我想就如我那時ABI 跟我說出在轉cDNA,因為RT我並是用kit,而是各家廠商東奏西奏去轉的... 其實,我覺得不是操作的問題....操作的基本手則大家應該都一樣, 感覺問題不大... 其實我現在比較想知道,若是cDNA沒轉好,導致PCR做的出來而q-PCR做不出來.. 除了重抽外,有啥補救措施....拜託各位高手(因為我的檢體不太可能再重抽了..><) : 另外你的反應做大於40 cycle,然後Ct只會在40以後出現 : 我也如bloodgas大大會建議你看一下internal control的Ct會在多少出現? : 可以一併確認是quality的問題 或者你的基因表現就是低到不行 : 希望對你有所幫助 : : 1.是的,要盡可能精準 : : 2.我們實驗室用的是Roche的機器,不過所有program的溫度跟時間都可以調整,因為每一個 : : 基因都不一樣,同樣的條件不可能適用於所有PCR,所以一定要optimization,ABI機器 : : 沒用過,所謂的不能改條件意思是???? : : 3.RNA用column抽或是TRIZOL抽都一樣,quality沒問題,reverse transcription只要沒有 : : RNase污染就沒問題 : : 4.要check RNA quality就直接跑個gel來看,28S/18S的band正確,比例也正確就可以 : : 5.crossing point 40是太低了,應該就是沒有東西吧...你測過抽出來的RNA的濃度嗎? : : 你是用多少total RNA下去做reverse transcription? 一般都用0.5-1 ug, 另外, : : 你做過house keeping gene的real-time PCR嗎?這樣可以直接確定你的cDNA有沒有問題. : : 還有一點就是可以加上一個positive control,plasmid或是PCR fragment,這樣才能 : : 確定至少real time PCR的過程沒有問題.. : : 以上 --

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