※ 引述《puec ()》之銘言： : ※ 引述《shuo218 (快樂的理由)》之銘言： : 恩，妳的菌養太老了。解決的方法有兩個 : 1: 增加抗生素的濃度，(100ug/ml for ampicillin or 25 ug/ml for Kanamycin) : 2. 縮短養菌的時間。 : 妳可能會問，妳是照protocol養16小時，為什麼會太老。有幾個可能性 : a. 妳的抗生素加太少。抗生素濃度越高，只要是在菌可以忍受的範圍內， : plasmid的品質就會越好。 : b. 每隻菌在不同的medium裡面生長速度不依樣，同一種medium用不同牌子 : 的藥品配出來的效果也不一樣。同一個牌子的藥品，用不同的水去配， : 結果也會不一樣。 : c. 妳的colony可能很大顆。有可能是菌真的長很好，也有可能妳偷懶回家 : 前才挑colony，然後想說隔天下午來抽plasmid就好。反正要放16小時嘛。 : 前一天晚上在實驗室混到11點挑colony第二天可以混到下午3點才開始做 : 實驗。想想看，2mm的colony裡面的菌比1mm的colony多多少？答案是4倍！ : 如果1mm的colony養16小時是剛剛好，那妳是人家的四倍，那妳養了16小時 : 妳的菌量就是人家的4倍。妳不覺得很可怕嗎？ : 如果妳要問"為什麼養太老的菌plasmid會變很少"。 : 因為medium裡面的抗生素的量有限，當妳養過頭以後，medium裡面的抗生素都已經被 : 分解光了，這時候一些沒有帶plasmid或是plasmid量很少的菌就會出頭天。因為他們不 : 需要再花時間去複製妳的plasmid，所以會長得比有帶plasmid的菌還要快，到了最後， : medium裡面大部分就都是沒有plasmid的菌了，所以自然你就抽不到plasmid了。 : 希望這可以解決妳的問題。 先謝謝這位板友精采詳細的解說 根據大家的解答，我想我也發現了自己的問題 (1)搖菌前，我挑的其實不是colony了，可以說是挑了一坨菌到broth裡面去長，而且搖 菌的時間還長達快要24小時，所以菌量太多是一個問題所在 但是我想問，因為我們實驗室用的是DH-5alpha的E.coli，他的copy number好像並不高， 那如果我照promega的protocol所說的low-copy-number plasmids最多可用到10ml增菌， 那增菌完要抽plasmid時，是不是再分裝成較少體積的量再抽會比較好? 那減少養菌時間，那到底要多久呢?其實我養到後面要做實驗的時候，都已經可以看到一 些絲狀的懸浮物跟沉澱在下面，那樣好像就是細菌死掉了? 恩~我想經由大家的解答之後，我再試試看好了，希望能有比較高的濃度 謝謝大家!! --

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