※ 引述《fjubiology (Science閱讀俱樂部)》之銘言： : ※ 引述《paua (waiting for good news)》之銘言： : : 我染PI出現兩個問題, : : 麻煩請幫我看圖中紅色的部分, 謝謝 ^^ : : 這是以前染的fibroblast, 是成功的 http://tinyurl.com/y9jpnb : : 問題一 相同種類細胞, 但是染到細胞質, 且核部分不明顯 http://tinyurl.com/ygtgfb : 有可能是染劑未完全進入標地位置以及未沖洗乾淨(撇開您細胞質紅色影像為其他抗 : 體之紅色螢光)。此張影像似乎有過飽和的感覺(背景都是綠的，理論上應該是黑色) : 建議： : 染完後用PBS多洗幾次，此外PI是鑲嵌於DNA雙股中。另外細胞質內有mitochondria : ，其也含DNA，PI也會染到(一隻mitochondria有百個DNA copy) : : 問題二 不同種細胞(keratinocyte), 為什麼核中有圓圓區域染不到 : : keratinocyte A: http://tinyurl.com/yc6g5g : : keratinocyte B: http://tinyurl.com/ycdpt8 : : 是因為不同種類細胞而有的特徵嗎? : : 可是我實在想不出來那應該是細胞核的哪一個細部位置? 有些人說是核仁, : : 但核仁的顏色應該要比較深(紅), 不是嗎? : 染有DNA的地方。你AB兩張拍到的是正常情況下confocal MS看到的PI結果 : 造成你問題一與二PI染色的結果不同，除了上述之外還有可能是機器操作的問題 : 雷射強度過強造成訊號過度飽和，pinhole開太大，雜訊過多都會造成細胞核染PI後一 : 團紅。依本人多年操作confocal MS經驗只有細胞核皺縮才會染到一團紅紅的。 : 改善實驗建議： : 使用confocal MS 時pinhole盡量小，雷射強度也是。若訊號過低時建議先稍稍調高雷射 : 視結果再調pinhole。相信萊卡，蔡斯，bio-rad等品牌都有影像重複疊合最佳化的介面 : (kalman等方式)，利用短時間重複掃描計算得到最佳影像。 : : 我處理步驟都一樣(每個步驟之間都用PBS wash三次): : : 1. 細胞固定: 2% paraformaldehyde, 15min, RT : : 2. 打 洞: 0.1% triton X-100, 10min, RT : : 3. blocking: 1% FBS in PBS 1-2hr, RT : : 4. 染 一 抗: 這部分沒有問題, 暫不討論 : : 5. 染 二 抗: 同上 : : 6. 染 核 PI: 4ug/mL, 5min, RT : : 7. 封 片 : 一個曾經以玩confocal MS為興趣的過來人 我幫你看過你的DATA了 以第二張為主作討論 請直接換掉原來使用的PI 重新泡過新的..(新鮮很重要) 再重新試試看... 另外 PI染完要記得也要用PBS wash3次 大概是這樣 因為第一張圖的確是成功的 代表手法沒問題 confocal也沒問題 再來不同的細胞的確染出來的PI效果會不一樣 基本上你的keratinocytes圖算是合理的 如果你希望連裡面的核仁都染到的話 改變打洞時間和染PI時間 應該會有點改善 confocal的強度亮度基本上是OK的 但是以P大所說的 第二張圖的背景的確過量 可以以P大的方式來改善背景問題 我曾經是confocal操作員 學生常有像你一樣的問題 所以大致照上面情形改善吧 如果仍然有問題 再詳細點說明你的情況囉... 加油加油... --

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