作者bluejelly (夢裡不知身是客)
看板Biotech
標題[問題] Colony PCR: false positive?
時間Wed Dec 13 08:03:20 2006
最近在做很多組cloning
為了省時間省耗材
我以colony PCR找有insert的colony
我先以tip挑菌落 沾到50ul的水中
以95度C加熱十分鐘
再以這個水補滿PCR reaction所需的體積
(dNTP, buffer, Taq, primer都照加 剩下體積用這個補)
(這是敝實驗室運作得很好的colony PCR protocol)
我的各reagent濃度都與為先前cloning而跑的PCR相同
program設定也很接近
昨天三組不同的cloning 各挑四個colony
十二個colony跑出來都有正確大小的band
但我不是很信任colony PCR 所以又養了菌今天抽mini-prep
以restriction enzyme digestion再次確認
發現十二個colony中 只有兩個是正確的
其他十個都是empty vector
請問有人知道為什麼我的colony PCR會有這麼高的false positive rate嗎?
而且為什麼明明沒insert
卻可以跑得出正確大小的band? 而且都跑得很乾淨漂亮 只有一條很亮的正確band
我百思不得其解 @@
會影響stringecy的幾個主要因素我控制如下:
[Mg2+]=2.5mM, annealing T = 52度, 無DMSO
還請熟悉colony PCR的人賜教 謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 24.162.236.21
1F：推 enisx:ㄧ個菌裡面 有含insert 及沒insert的 vextor 12/13 08:32
2F：→ enisx:沒含insert的數量少很多但是被PCR放大了 12/13 08:33
3F：→ enisx:o/n culture 後 沒insert 長的快多了,當然你mini得到的 12/13 08:33
4F：→ enisx:都是這些沒insert的 12/13 08:35
5F：推 Fourfish:建議不要用破菌的水當H2O用 取一般PCR時template的量就好 12/13 23:21
6F：→ Fourfish:這樣應該可以降低false positive的狀況 12/13 23:25
7F：→ Fourfish:另外可以查查看你的primer會不會和vector產生annealing 12/13 23:27
8F：推 bluejelly:謝謝兩位 我想就是像e板友說的 PCR太敏感了 12/14 11:08
9F：→ bluejelly:因我後來發現RE切有insert的 colony PCR會特亮 12/14 11:09
10F：→ bluejelly:稍提高stringecy或減少template大概會比較好~ 12/14 11:10