作者eatofy (平常心)
看板Biology
標題[問題] western blot band不均勻
時間Thu Sep 2 20:23:58 2010
【問題】：western blot 再running時，靠近marker的well都會斜一邊。
壓完片後，每個well的band不均勻
我是用0.75的膠 runnung 100v 1hr
transfer 400A 1.5hr
全程on ice
【問題起因】：一開始以為是蛋白質定量的問題，一直再練習
現在定量都控制R^2 0.99。也有請學長幫我，照我定量
出來的配方，配sample。
但是，同一片膠，有我自己配的sample與學長配的sample
跑出來的band全部都不均勻，影像分析的結果當然是差異很大
(練習跑b actin)
【個人看法】：不太曉得是甚麼原因= =a 定量方面的R^2因該是沒問題
難道會是在loading 到well時出錯?
sample我是跑膠前天準備好，冰再-20，
跑膠前退冰、votex直接loading <===會是這問題嗎?
麻煩大家幫我解決? 謝謝
這是我壓出來的圖
http://0rz.tw/naJ50
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.71.89
1F：推 aeroufo:你做膠會不會有問題呀?? 09/02 23:50
2F：→ chungwt:會不會你在洗抗體的時候 是直接從中間出下去? 09/03 00:39
3F：→ chungwt:這樣還滿容易把抗體沖起來的耶!? 09/03 00:40
4F：→ genep:有圖嗎? 09/03 01:04
※ 編輯: eatofy 來自: 120.126.71.89 (09/05 23:03)
※ eatofy:轉錄至看板 Biotech 09/05 23:07
5F：推 vixen:每個well loading的"體積"是否一樣? 09/06 10:57
6F：→ eatofy:我這次跑的 體積都調一樣 結果還是如此 09/06 20:13
7F：推 vixen:BioRAD的器材嗎?跑膠時,內外溶液都加到滿,跑慢一點+stir bar 09/06 20:40
8F：→ blence:內外溶液都要加到滿很明顯就是錯誤的做法 09/06 22:54
9F：推 vixen:我是想可能因為內外溫差導致tailing, 這錯誤是錯在何處呢? 09/07 21:48
10F：→ blence:Biorad,160V,>1h,30~50ug load,這是我的條件,可是沒那情況 09/07 23:14
11F：→ blence:何況我在室溫跑阿 09/07 23:15
12F：→ blence:我不否定溫度可能影響結果,而是覺得溫度為果,真正且未知的 09/07 23:17
13F：→ blence:"因"才是需要解決的; 就想很多人內層都會漏,所以內外buffer 09/07 23:19
14F：→ blence:加一樣多就不會漏了,但是其實實驗不該是這樣解決的,不是嗎? 09/07 23:20
15F：推 vixen:我想這是實驗觀點不一樣吧, 不一定能算為錯誤. 比方我個人認 09/08 12:27
16F：→ vixen:為我們做是要問出與解決科學問題,而不是花時間解決漏buffer 09/08 12:28
17F：→ vixen:有時繞過問題也許可以更快找出答案. 當然不是說你觀點不對啦 09/08 12:29
18F：推 vixen:我猜想原po全程在ice上跑,內外溫差導致內外層擴散速率不同 09/08 12:30
19F：→ vixen:可能會導致tailing. Biorad與Owl跑膠設備都留stir bar空間 09/08 12:31
20F：→ vixen:為的也是希望溫度能在跑膠時更驅平衡不是嗎? 09/08 12:31