作者eatofy (平常心)
看板Biology
标题[问题] western blot band不均匀
时间Thu Sep 2 20:23:58 2010
【问题】：western blot 再running时，靠近marker的well都会斜一边。
压完片後，每个well的band不均匀
我是用0.75的胶 runnung 100v 1hr
transfer 400A 1.5hr
全程on ice
【问题起因】：一开始以为是蛋白质定量的问题，一直再练习
现在定量都控制R^2 0.99。也有请学长帮我，照我定量
出来的配方，配sample。
但是，同一片胶，有我自己配的sample与学长配的sample
跑出来的band全部都不均匀，影像分析的结果当然是差异很大
(练习跑b actin)
【个人看法】：不太晓得是甚麽原因= =a 定量方面的R^2因该是没问题
难道会是在loading 到well时出错?
sample我是跑胶前天准备好，冰再-20，
跑胶前退冰、votex直接loading <===会是这问题吗?
麻烦大家帮我解决? 谢谢
这是我压出来的图
http://0rz.tw/naJ50
--
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.71.89
1F：推 aeroufo:你做胶会不会有问题呀?? 09/02 23:50
2F：→ chungwt:会不会你在洗抗体的时候 是直接从中间出下去? 09/03 00:39
3F：→ chungwt:这样还满容易把抗体冲起来的耶!? 09/03 00:40
4F：→ genep:有图吗? 09/03 01:04
※ 编辑: eatofy 来自: 120.126.71.89 (09/05 23:03)
※ eatofy:转录至看板 Biotech 09/05 23:07
5F：推 vixen:每个well loading的"体积"是否一样? 09/06 10:57
6F：→ eatofy:我这次跑的 体积都调一样 结果还是如此 09/06 20:13
7F：推 vixen:BioRAD的器材吗?跑胶时,内外溶液都加到满,跑慢一点+stir bar 09/06 20:40
8F：→ blence:内外溶液都要加到满很明显就是错误的做法 09/06 22:54
9F：推 vixen:我是想可能因为内外温差导致tailing, 这错误是错在何处呢? 09/07 21:48
10F：→ blence:Biorad,160V,>1h,30~50ug load,这是我的条件,可是没那情况 09/07 23:14
11F：→ blence:何况我在室温跑阿 09/07 23:15
12F：→ blence:我不否定温度可能影响结果,而是觉得温度为果,真正且未知的 09/07 23:17
13F：→ blence:"因"才是需要解决的; 就想很多人内层都会漏,所以内外buffer 09/07 23:19
14F：→ blence:加一样多就不会漏了,但是其实实验不该是这样解决的,不是吗? 09/07 23:20
15F：推 vixen:我想这是实验观点不一样吧, 不一定能算为错误. 比方我个人认 09/08 12:27
16F：→ vixen:为我们做是要问出与解决科学问题,而不是花时间解决漏buffer 09/08 12:28
17F：→ vixen:有时绕过问题也许可以更快找出答案. 当然不是说你观点不对啦 09/08 12:29
18F：推 vixen:我猜想原po全程在ice上跑,内外温差导致内外层扩散速率不同 09/08 12:30
19F：→ vixen:可能会导致tailing. Biorad与Owl跑胶设备都留stir bar空间 09/08 12:31
20F：→ vixen:为的也是希望温度能在跑胶时更驱平衡不是吗? 09/08 12:31