※ [本文轉錄自 Biotech 看板] 作者: badpipi (小山豬) 看板: Biotech 標題: [求救] 如何研究某蛋白的功能是estrogen receptor dependent的 時間: Sat Jun 21 11:51:32 2008 如題 想請教版友 已知protein A是一DNA methyltransferase (well known) 目前有一新發現:estrogen receptor alpha(ERa)與E2 (estrogen receptor的ligand)結合後, 會recruit 好幾種蛋白與protein A結合在 pS2 promoter上, 同時 此promoter上的5-mCpG發生demethylation; 作者另外以in vitro的方式 發現protein A具有deaminase的能力, 可以將5-mC變成T 附註:1. protein A: Dnmt3a及Dnmt3b, 已知的DNA methyltransferase, 會促使 C變成5-mC 2. pS2(TIFF1):已知的estrogen receptor alpha target gene, promoter上有 estrogen response element 3. 已知estrogen receptor alpha會與TDG(thymine DNA glycosylase)結合 ,所以作者推測 Dnmt3a與(或)Dnmt3b造成5-mC的deamination變成T, 造成 mismatch, 進而由TDG及其他相關蛋白進行base excision repair 4. 以前沒有發現過Dnmt3a或Dnmt3b具有deaminase的能力, 只知 DNA methyltransferase activity 5. 加入ICI 182780(estrogen receptor alpha的antagonist), 會使ERa及 Dnmt3a.Dnmt3b都不能結合到此promoter上 因此, 我想探究為什麼Dnmt3a及Dnmt3b在此情況下能做deamination,進而引起 DNA demethylation 我的推測:Dnmt3a及Dnmt3b具有deaminase activity, 參與在DNA demethylation是 estrogen receptor alpha dependent 目前遭遇的困難: 要如何證明Dnmt3a及Dnmt3b具有deaminase activity是因為ERa 將他們聚集到此promoter上之後, 才具有這樣的功能 我想應該無法使用將ERa knockdown或是ERa antogonist的方式, 因為如果ERa不存在或是ERa不能作用, 則Dnmt3a及Dnmt3b就無法 bind上此promoter,就無法證明是否: "Dnmt3a及Dnmt3b具有deaminase activity是因為ERa 將他們聚集到此promoter上之後, 才具有這樣的功能" 可是我又想不出有什麼方法或策略可以證明.研究 所以想請版友提供我一些想法及建議 謝謝 拜託拜託 謝謝大家 --

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