※ [本文转录自 Biotech 看板] 作者: badpipi (小山猪) 看板: Biotech 标题: [求救] 如何研究某蛋白的功能是estrogen receptor dependent的 时间: Sat Jun 21 11:51:32 2008 如题 想请教版友 已知protein A是一DNA methyltransferase (well known) 目前有一新发现:estrogen receptor alpha(ERa)与E2 (estrogen receptor的ligand)结合後, 会recruit 好几种蛋白与protein A结合在 pS2 promoter上, 同时 此promoter上的5-mCpG发生demethylation; 作者另外以in vitro的方式 发现protein A具有deaminase的能力, 可以将5-mC变成T 附注:1. protein A: Dnmt3a及Dnmt3b, 已知的DNA methyltransferase, 会促使 C变成5-mC 2. pS2(TIFF1):已知的estrogen receptor alpha target gene, promoter上有 estrogen response element 3. 已知estrogen receptor alpha会与TDG(thymine DNA glycosylase)结合 ,所以作者推测 Dnmt3a与(或)Dnmt3b造成5-mC的deamination变成T, 造成 mismatch, 进而由TDG及其他相关蛋白进行base excision repair 4. 以前没有发现过Dnmt3a或Dnmt3b具有deaminase的能力, 只知 DNA methyltransferase activity 5. 加入ICI 182780(estrogen receptor alpha的antagonist), 会使ERa及 Dnmt3a.Dnmt3b都不能结合到此promoter上 因此, 我想探究为什麽Dnmt3a及Dnmt3b在此情况下能做deamination,进而引起 DNA demethylation 我的推测:Dnmt3a及Dnmt3b具有deaminase activity, 参与在DNA demethylation是 estrogen receptor alpha dependent 目前遭遇的困难: 要如何证明Dnmt3a及Dnmt3b具有deaminase activity是因为ERa 将他们聚集到此promoter上之後, 才具有这样的功能 我想应该无法使用将ERa knockdown或是ERa antogonist的方式, 因为如果ERa不存在或是ERa不能作用, 则Dnmt3a及Dnmt3b就无法 bind上此promoter,就无法证明是否: "Dnmt3a及Dnmt3b具有deaminase activity是因为ERa 将他们聚集到此promoter上之後, 才具有这样的功能" 可是我又想不出有什麽方法或策略可以证明.研究 所以想请版友提供我一些想法及建议 谢谢 拜托拜托 谢谢大家 --

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