※ [本文轉錄自 Biotech 看板] 作者: latte366 ( ) 看板: Biotech 標題: Re: [求救] Medium跑western 時間: Thu Mar 13 04:34:54 2008 : ※ 引述《[email protected] (六百)》之銘言： : : ※ 引述《[email protected] (昂 布拉股)》之銘言： : : > 最近要看一些外送到Medium中的protein : : > 所以將medium拿去跑western : : > 但是總是偶而會有band 較多時候有時候都沒有訊號 而且片子的background都髒髒的 : : > 我的方法是 先將約100ul的Medium加入loading dye之後下去煮過 : : > 將體積煮至40~50之後 loading : : > 但是有時候煮過會發現底部有一些藍色的沉澱物 : : > 但是我還是全部loading下去 : : 這種煮到乾的做法有文獻可考嗎？ : : 感覺有點可怕 : : 而且我直覺認為鹽類濃度的改變會對結果造成一些難以預期的影響 : : 如果是我 我會用 centricon 之類的東西來濃縮啦... : : 或者是作 IP or IP-western ^^^^^^^^^^^^^^^^^這是指用免疫沈澱法 取出我要的protein 然後再跑western嗎？ 不曉得有沒有誤解您的意思 : 我想問你的是...你的medium裡有沒有serum.. : 聚我所知..serum影響很大 : 跑出來會有黑色ㄧ團 : 我後來是用serum free... : 取2-3ml的medium濃縮至50-70 ul後加 loading dye煮 : 然後用well比較大的去跑 : 我是上層膠配比較長(也就是下層膠要比較短) : 然後讓他跑一下下之後再把沒loading完的load完 : ^^ 借個標題 我也是用濃縮的方式來濃縮我的medium (DMEM/F12;含2％serum) 方法是以抽真空的方式將體積濃縮 整個chamber的溫度大概10度C左右 也就是我裝sample的離心管也是10度C 總體積8ml-->200~500ul 約需6～8小時 我的問題是： 1. 像這樣沒有加protease、phosphorease inhibitor有沒有關係呢？ 雖然我不是要看phosphoration 但還是會擔心degrade的問題 2. 如果要加 各位會選擇在濃縮之前加還是濃縮之後再加 前者我擔心會有鹽類過高問題而且需要加的量要很多（一管8ml 有12管） 後者我擔心在濃縮過程就有degrade了 濃縮後再加 會不會就失去時效性 補充： 我跟同學討論 有想說是不是先加個不是鹽類的inhibitor 如： PMSF頂一下 不過各位也知道 PMSF的半衰期約30min~60min Aprotinin、Leupeptinin、Pepstatin 我不曉得是否很貴 如果很貴 大概也不能讓我拿來這樣揮霍 而其它如 NaCl、Na3VO4、NaF都會影響鹽的濃度 tris-base、 Na-deoxycholate會不會我不清楚( tris應該也會吧?!） 爬前文 有人說Aprotinin、Leupeptinin、Pepstatin、PMSF加多沒關係 所以我才把濃縮產生的問題專注在其它鹽類 雖然我也不確定是不是就真的上述四者不會影響 我知道millipore有賣 centricon Ampicon這種透析的管子 不過真的太貴了....orz 希望有前輩可以分享一下這方面的看法 感恩 ^^ ※ 編輯: latte366 來自: 140.116.93.52 (03/13 04:38) --

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