※ [本文转录自 Biotech 看板] 作者: latte366 ( ) 看板: Biotech 标题: Re: [求救] Medium跑western 时间: Thu Mar 13 04:34:54 2008 : ※ 引述《[email protected] (六百)》之铭言： : : ※ 引述《[email protected] (昂 布拉股)》之铭言： : : > 最近要看一些外送到Medium中的protein : : > 所以将medium拿去跑western : : > 但是总是偶而会有band 较多时候有时候都没有讯号 而且片子的background都脏脏的 : : > 我的方法是 先将约100ul的Medium加入loading dye之後下去煮过 : : > 将体积煮至40~50之後 loading : : > 但是有时候煮过会发现底部有一些蓝色的沉淀物 : : > 但是我还是全部loading下去 : : 这种煮到乾的做法有文献可考吗？ : : 感觉有点可怕 : : 而且我直觉认为盐类浓度的改变会对结果造成一些难以预期的影响 : : 如果是我 我会用 centricon 之类的东西来浓缩啦... : : 或者是作 IP or IP-western ^^^^^^^^^^^^^^^^^这是指用免疫沈淀法 取出我要的protein 然後再跑western吗？ 不晓得有没有误解您的意思 : 我想问你的是...你的medium里有没有serum.. : 聚我所知..serum影响很大 : 跑出来会有黑色ㄧ团 : 我後来是用serum free... : 取2-3ml的medium浓缩至50-70 ul後加 loading dye煮 : 然後用well比较大的去跑 : 我是上层胶配比较长(也就是下层胶要比较短) : 然後让他跑一下下之後再把没loading完的load完 : ^^ 借个标题 我也是用浓缩的方式来浓缩我的medium (DMEM/F12;含2％serum) 方法是以抽真空的方式将体积浓缩 整个chamber的温度大概10度C左右 也就是我装sample的离心管也是10度C 总体积8ml-->200~500ul 约需6～8小时 我的问题是： 1. 像这样没有加protease、phosphorease inhibitor有没有关系呢？ 虽然我不是要看phosphoration 但还是会担心degrade的问题 2. 如果要加 各位会选择在浓缩之前加还是浓缩之後再加 前者我担心会有盐类过高问题而且需要加的量要很多（一管8ml 有12管） 後者我担心在浓缩过程就有degrade了 浓缩後再加 会不会就失去时效性 补充： 我跟同学讨论 有想说是不是先加个不是盐类的inhibitor 如： PMSF顶一下 不过各位也知道 PMSF的半衰期约30min~60min Aprotinin、Leupeptinin、Pepstatin 我不晓得是否很贵 如果很贵 大概也不能让我拿来这样挥霍 而其它如 NaCl、Na3VO4、NaF都会影响盐的浓度 tris-base、 Na-deoxycholate会不会我不清楚( tris应该也会吧?!） 爬前文 有人说Aprotinin、Leupeptinin、Pepstatin、PMSF加多没关系 所以我才把浓缩产生的问题专注在其它盐类 虽然我也不确定是不是就真的上述四者不会影响 我知道millipore有卖 centricon Ampicon这种透析的管子 不过真的太贵了....orz 希望有前辈可以分享一下这方面的看法 感恩 ^^ ※ 编辑: latte366 来自: 140.116.93.52 (03/13 04:38) --

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