作者wulito (考完悶的緊)
看板Biology
標題[問題] 關於使用 phenol - chloroform 抽DNA的方法
時間Tue May 2 23:52:04 2006
最近在嘗試這個方法 發現幾個問題想請問大家..
1.使用phenol - chloroform 萃取時 中間有層乳白色層 應該是蛋白質吧
應該要去掉 但發現不太好分離 往往都會被一起吸上來
而且白色層非常的厚
是因為proteinase K 反應不完全嗎
2.最後在跑電泳與 260 / 280 確認的時候
發現有兩條以上的亮帶 不曉得這樣算不算正常呢
此外在測 260 / 280 時 居然沒有吸光值
沒有吸光 又怎麼會有亮帶呢 好奇怪
我的實驗步驟如下:
1. overnight 菌液1.5ml 到入eppendorf中,離心3000 xg, 10 min
2. 用1 ml STE buffer washㄧ次
3. resuspend 在200 μl STE 中, 加入10 μl 20% SDS (final..1%) 混勻,
不可vortex
4. 放入65℃(water bath)/10 min, until cell lyse
5. 加入10μl proteinaes K, final:200 ng/ml, 37C, 3-4 hrs
6. 加入400 μl STE ,dilute,再加等體積的phenol/chloroform 萃取, 緩慢混合
7. 離心1000 xg/5 min, 以剪頭tip吸取上清液
8. 萃取至中間白色層消失, 約三次萃取
9. 加1/10體積 NaOAc(3M) , 混勻, 再加2V 95% EtOH 混勻
10. 用tip捲起DNA, 稍微晾乾,溶在50-100μl TE/DI 中
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◆ From: 140.120.200.44