作者wulito (考完闷的紧)
看板Biology
标题[问题] 关於使用 phenol - chloroform 抽DNA的方法
时间Tue May 2 23:52:04 2006
最近在尝试这个方法 发现几个问题想请问大家..
1.使用phenol - chloroform 萃取时 中间有层乳白色层 应该是蛋白质吧
应该要去掉 但发现不太好分离 往往都会被一起吸上来
而且白色层非常的厚
是因为proteinase K 反应不完全吗
2.最後在跑电泳与 260 / 280 确认的时候
发现有两条以上的亮带 不晓得这样算不算正常呢
此外在测 260 / 280 时 居然没有吸光值
没有吸光 又怎麽会有亮带呢 好奇怪
我的实验步骤如下:
1. overnight 菌液1.5ml 到入eppendorf中,离心3000 xg, 10 min
2. 用1 ml STE buffer washㄧ次
3. resuspend 在200 μl STE 中, 加入10 μl 20% SDS (final..1%) 混匀,
不可vortex
4. 放入65℃(water bath)/10 min, until cell lyse
5. 加入10μl proteinaes K, final:200 ng/ml, 37C, 3-4 hrs
6. 加入400 μl STE ,dilute,再加等体积的phenol/chloroform 萃取, 缓慢混合
7. 离心1000 xg/5 min, 以剪头tip吸取上清液
8. 萃取至中间白色层消失, 约三次萃取
9. 加1/10体积 NaOAc(3M) , 混匀, 再加2V 95% EtOH 混匀
10. 用tip卷起DNA, 稍微晾乾,溶在50-100μl TE/DI 中
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◆ From: 140.120.200.44