抱歉...我沒做過這個.... 不過我剛剛看了一下內容...有一個疑問... 37度是補nick的溫度.... 可是我沒看到dNTP或其他可補nick的東西.... 我不明瞭nick要怎麼補起來....可以解釋一下嗎...謝謝.. ※ 引述《[email protected] (Mares)》之銘言： > ※ [本文轉錄自 Biotech 看板] > 作者: Mares (Mares) 看板: Biotech > 標題: 請問用T4 DNA ligase做blunt-end ligation > 時間: Mon Dec 5 10:28:02 2005 > 各位前輩大家好 想請教一個ligation的技術問題 > 我想把設計好的linker (一端blunt一端sticky, blunt-end的5'有接磷酸) > 接上用HaeIII和RsaI切好(都是blunt-end RE) 去磷酸的的genomic DNA > 不過試了幾次 最後用PCR檢查發現都沒接上去... > 以下是我的recipe: > step1. 16'C 20min > step2. 16'C 30min > step3. 37'C 20min > step4. Goto step2, 29times > step5. 65'C 20min > end > -------------------------------------------------- > concentration > digested, CIP'ed genomic DNA 0.05 uM <--- 我知道很稀 不過沒辦法 > Tris-HCL 50 mM > MgCl2 10 mM > DTT 1 mM > Bovine Serum Albumin 25 ug/ml > linkers 2.5 uM <--- 文獻上說 > --------------------------------------------------- blunt-end ligation時 > linker:DNA fragment > = 40 ~ 100:1 > 是最理想的濃度範圍 > 這裡我是用 50:1 > 16'C是T4 DNA ligase形成phosphodiester bond的作用溫度 > 37'C則是補nick的溫度 > 65'C 20min用來heat kill > 我是用NEB的T4 DNA ligase > reaction condition都optimize到廠商的建議濃度了 > 其中BSA雖然成份有Na+和PO4- 原理上會阻礙ligation的效率 > 但是濃度相當低 (而且是NEB自己官方的配方) > 另外廠商的建議DNA濃度在 0.1~1uM之間 > 但是因為我的實驗題材DNA的取得困難 > 讓我的用量只能達到最小值的一半 (0.05uM) > linker濃度也做了三組 50:1 80:1 和 100:1 連130:1都做了 > 還是接不上去 > 不知道問題是出在哪裡? > 感謝 ~ -- ┌─────◆ＫＫＣＩＴＹ◆─────┐★☆ 數十萬首歌曲，22種音樂分類 ☆★ │ bbs.kkcity.com.tw │□□ 與各大唱片行同步的音樂收藏 □□ └──《From:140.116.144.210 》──┘快來~KKBOX →http://www.kkbox.com.tw --