抱歉...我没做过这个.... 不过我刚刚看了一下内容...有一个疑问... 37度是补nick的温度.... 可是我没看到dNTP或其他可补nick的东西.... 我不明了nick要怎麽补起来....可以解释一下吗...谢谢.. ※ 引述《[email protected] (Mares)》之铭言： > ※ [本文转录自 Biotech 看板] > 作者: Mares (Mares) 看板: Biotech > 标题: 请问用T4 DNA ligase做blunt-end ligation > 时间: Mon Dec 5 10:28:02 2005 > 各位前辈大家好 想请教一个ligation的技术问题 > 我想把设计好的linker (一端blunt一端sticky, blunt-end的5'有接磷酸) > 接上用HaeIII和RsaI切好(都是blunt-end RE) 去磷酸的的genomic DNA > 不过试了几次 最後用PCR检查发现都没接上去... > 以下是我的recipe: > step1. 16'C 20min > step2. 16'C 30min > step3. 37'C 20min > step4. Goto step2, 29times > step5. 65'C 20min > end > -------------------------------------------------- > concentration > digested, CIP'ed genomic DNA 0.05 uM <--- 我知道很稀 不过没办法 > Tris-HCL 50 mM > MgCl2 10 mM > DTT 1 mM > Bovine Serum Albumin 25 ug/ml > linkers 2.5 uM <--- 文献上说 > --------------------------------------------------- blunt-end ligation时 > linker:DNA fragment > = 40 ~ 100:1 > 是最理想的浓度范围 > 这里我是用 50:1 > 16'C是T4 DNA ligase形成phosphodiester bond的作用温度 > 37'C则是补nick的温度 > 65'C 20min用来heat kill > 我是用NEB的T4 DNA ligase > reaction condition都optimize到厂商的建议浓度了 > 其中BSA虽然成份有Na+和PO4- 原理上会阻碍ligation的效率 > 但是浓度相当低 (而且是NEB自己官方的配方) > 另外厂商的建议DNA浓度在 0.1~1uM之间 > 但是因为我的实验题材DNA的取得困难 > 让我的用量只能达到最小值的一半 (0.05uM) > linker浓度也做了三组 50:1 80:1 和 100:1 连130:1都做了 > 还是接不上去 > 不知道问题是出在哪里? > 感谢 ~ -- ┌─────◆ＫＫＣＩＴＹ◆─────┐★☆ 数十万首歌曲，22种音乐分类 ☆★ │ bbs.kkcity.com.tw │□□ 与各大唱片行同步的音乐收藏 □□ └──《From:140.116.144.210 》──┘快来~KKBOX →http://www.kkbox.com.tw --