※ 引述《[email protected] (好想學鋼琴阿!!)》之銘言： > 轉信站: KimoWebBBS!netnews.kimo.com.tw!news.csie.ncu!news.ncu!ctu-peer!ctu-read > Origin: sally.csie.ntu.edu.tw > ※ 引述《[email protected] (u860427)》之銘言： > : ※ 引述《[email protected] ()》之銘言： > : > 轉信站: KimoWebBBS!netnews.kimo.com.tw!news.csie.ncu!news.ncu!ctu-peer!news.nct > : > Origin: bbs.nsysu.edu.tw > : > 為何我的6xHis-protein在nickel column拉梯度之初,就被洗出來? > : > 我利用大腸桿菌來表現6xHis-protein, > : > 經過IPTG誘導後, > : > 破菌! > : > 將上清液灌入nickel column, > : > 在wash時, 沒事! > : > 但是在0~500 mM imidazole拉梯度（二十倍體積）之初, > : > 我的6xHis-protein 在一開始（一倍體積）體積, 就被洗出來! > : > 所以我的nickel column拉梯度圖, > : > 就在最前面只出現了一根很大根的peak! > : > 然後就持平到最後, > : > 經過western blotting分析後才發現, > : > 我的6xHis-protein在前面這根很大根的peak裡面, > : > 但是這根很大根的peak裡面還伴隨著數百種蛋白質, > : > 請問怎麼會這樣呀? > : 有幾種可能 > : 1.你把His tag接在protein的哪一端? > : 在N-ter的話因為它是先被製造出來的,所以很可能folding時被包進去了,造成binding能力不足.建議接在C-ter > : 2.設計時的問題 > : 若His tag本身離protein太近也會造成tag無法隨意飄動,或幅度太小,建議可於prtein與tag間加上一個cutting site (ex:factor X)反正也方便將純化後的tag切掉,或者是多接一點His,我一般都用10個His喔 > : 3.實驗準備上的問題 > : 你的column用了多次的話就應該要re-charge,或column中的EDTA或imidazole是否有清洗乾淨.再者你的所有buffer是否有會干擾實驗的物質,或你的梯度拉的太快,loading時流速過高,都會有所影響喔 > : 4.命不好 > : 其實做蛋白質實驗常常會是聽天由命的,表現量,純化結果等等.基本上本人也發身過許多次.但基本上盡力而為囉 > 5.charge可以試試鈷離子... > binding較強 我沒用過ㄝ...可以試看看..不過...好像比較貴對吧?! > 6.試試GST或是MBP fusion protein吧.... > His-tag我覺得不太好用.... GST是不錯..但一般的實驗室不大會有純化用的column..除非專門有在做純化的.而且我記得價錢並不便宜.而且干擾基本上還是有. BMP的話.他size也蠻大的喔.所以如果你的protein也很大.我就不建議.因為這樣產量會變小很多.一般大protein出現的問題他也會出現.再者.如果你是要做分析等等.那你變得必須要先將MBP切下來.再分離一次(可以用size cut membrane)以免實驗上被干擾或是被人質疑(畢竟His的影響不大).MBP通常是接在N-ter所以你的protein是接在他之後.其實有可能你的protein的結構會被干擾喔(我出現過一次)而且我是覺得binding效果普通啦. 但是如果你是較小的protein或是不可溶蠻多的,那我到覺得可以一試.因為BMP可以幫助folding及soluable,但是我學姊發生過一切下BMP他自己的protein就跟著掛了的情形(因為又變回不溶).若你是做結構的話..也可以試看看.因為BMP在解結構時會可以用MR代.會比較方便. -- ※ Origin: 奇摩 大摩域 <http://bbs.kimo.com.tw/> ◆ From: 211.22.52.145