※ 引述《[email protected] (好想学钢琴阿!!)》之铭言： > 转信站: KimoWebBBS!netnews.kimo.com.tw!news.csie.ncu!news.ncu!ctu-peer!ctu-read > Origin: sally.csie.ntu.edu.tw > ※ 引述《[email protected] (u860427)》之铭言： > : ※ 引述《[email protected] ()》之铭言： > : > 转信站: KimoWebBBS!netnews.kimo.com.tw!news.csie.ncu!news.ncu!ctu-peer!news.nct > : > Origin: bbs.nsysu.edu.tw > : > 为何我的6xHis-protein在nickel column拉梯度之初,就被洗出来? > : > 我利用大肠杆菌来表现6xHis-protein, > : > 经过IPTG诱导後, > : > 破菌! > : > 将上清液灌入nickel column, > : > 在wash时, 没事! > : > 但是在0~500 mM imidazole拉梯度（二十倍体积）之初, > : > 我的6xHis-protein 在一开始（一倍体积）体积, 就被洗出来! > : > 所以我的nickel column拉梯度图, > : > 就在最前面只出现了一根很大根的peak! > : > 然後就持平到最後, > : > 经过western blotting分析後才发现, > : > 我的6xHis-protein在前面这根很大根的peak里面, > : > 但是这根很大根的peak里面还伴随着数百种蛋白质, > : > 请问怎麽会这样呀? > : 有几种可能 > : 1.你把His tag接在protein的哪一端? > : 在N-ter的话因为它是先被制造出来的,所以很可能folding时被包进去了,造成binding能力不足.建议接在C-ter > : 2.设计时的问题 > : 若His tag本身离protein太近也会造成tag无法随意飘动,或幅度太小,建议可於prtein与tag间加上一个cutting site (ex:factor X)反正也方便将纯化後的tag切掉,或者是多接一点His,我一般都用10个His喔 > : 3.实验准备上的问题 > : 你的column用了多次的话就应该要re-charge,或column中的EDTA或imidazole是否有清洗乾净.再者你的所有buffer是否有会干扰实验的物质,或你的梯度拉的太快,loading时流速过高,都会有所影响喔 > : 4.命不好 > : 其实做蛋白质实验常常会是听天由命的,表现量,纯化结果等等.基本上本人也发身过许多次.但基本上尽力而为罗 > 5.charge可以试试钴离子... > binding较强 我没用过ㄝ...可以试看看..不过...好像比较贵对吧?! > 6.试试GST或是MBP fusion protein吧.... > His-tag我觉得不太好用.... GST是不错..但一般的实验室不大会有纯化用的column..除非专门有在做纯化的.而且我记得价钱并不便宜.而且干扰基本上还是有. BMP的话.他size也蛮大的喔.所以如果你的protein也很大.我就不建议.因为这样产量会变小很多.一般大protein出现的问题他也会出现.再者.如果你是要做分析等等.那你变得必须要先将MBP切下来.再分离一次(可以用size cut membrane)以免实验上被干扰或是被人质疑(毕竟His的影响不大).MBP通常是接在N-ter所以你的protein是接在他之後.其实有可能你的protein的结构会被干扰喔(我出现过一次)而且我是觉得binding效果普通啦. 但是如果你是较小的protein或是不可溶蛮多的,那我到觉得可以一试.因为BMP可以帮助folding及soluable,但是我学姊发生过一切下BMP他自己的protein就跟着挂了的情形(因为又变回不溶).若你是做结构的话..也可以试看看.因为BMP在解结构时会可以用MR代.会比较方便. -- ※ Origin: 奇摩 大摩域 <http://bbs.kimo.com.tw/> ◆ From: 211.22.52.145