※ 引述《[email protected] ()》之銘言： > 轉信站: KimoWebBBS!netnews.kimo.com.tw!news.csie.ncu!news.ncu!ctu-peer!news.nct > Origin: bbs.nsysu.edu.tw > 為何我的6xHis-protein在nickel column拉梯度之初,就被洗出來? > 我利用大腸桿菌來表現6xHis-protein, > 經過IPTG誘導後, > 破菌! > 將上清液灌入nickel column, > 在wash時, 沒事! > 但是在0~500 mM imidazole拉梯度（二十倍體積）之初, > 我的6xHis-protein 在一開始（一倍體積）體積, 就被洗出來! > 所以我的nickel column拉梯度圖, > 就在最前面只出現了一根很大根的peak! > 然後就持平到最後, > 經過western blotting分析後才發現, > 我的6xHis-protein在前面這根很大根的peak裡面, > 但是這根很大根的peak裡面還伴隨著數百種蛋白質, > 請問怎麼會這樣呀? 有幾種可能 1.你把His tag接在protein的哪一端? 在N-ter的話因為它是先被製造出來的,所以很可能folding時被包進去了,造成binding能力不足.建議接在C-ter 2.設計時的問題 若His tag本身離protein太近也會造成tag無法隨意飄動,或幅度太小,建議可於prtein與tag間加上一個cutting site (ex:factor X)反正也方便將純化後的tag切掉,或者是多接一點His,我一般都用10個His喔 3.實驗準備上的問題 你的column用了多次的話就應該要re-charge,或column中的EDTA或imidazole是否有清洗乾淨.再者你的所有buffer是否有會干擾實驗的物質,或你的梯度拉的太快,loading時流速過高,都會有所影響喔 4.命不好 其實做蛋白質實驗常常會是聽天由命的,表現量,純化結果等等.基本上本人也發身過許多次.但基本上盡力而為囉 -- ※ Origin: 奇摩 大摩域 <http://bbs.kimo.com.tw/> ◆ From: 218.166.130.76