※ 引述《[email protected] ()》之铭言： > 转信站: KimoWebBBS!netnews.kimo.com.tw!news.csie.ncu!news.ncu!ctu-peer!news.nct > Origin: bbs.nsysu.edu.tw > 为何我的6xHis-protein在nickel column拉梯度之初,就被洗出来? > 我利用大肠杆菌来表现6xHis-protein, > 经过IPTG诱导後, > 破菌! > 将上清液灌入nickel column, > 在wash时, 没事! > 但是在0~500 mM imidazole拉梯度（二十倍体积）之初, > 我的6xHis-protein 在一开始（一倍体积）体积, 就被洗出来! > 所以我的nickel column拉梯度图, > 就在最前面只出现了一根很大根的peak! > 然後就持平到最後, > 经过western blotting分析後才发现, > 我的6xHis-protein在前面这根很大根的peak里面, > 但是这根很大根的peak里面还伴随着数百种蛋白质, > 请问怎麽会这样呀? 有几种可能 1.你把His tag接在protein的哪一端? 在N-ter的话因为它是先被制造出来的,所以很可能folding时被包进去了,造成binding能力不足.建议接在C-ter 2.设计时的问题 若His tag本身离protein太近也会造成tag无法随意飘动,或幅度太小,建议可於prtein与tag间加上一个cutting site (ex:factor X)反正也方便将纯化後的tag切掉,或者是多接一点His,我一般都用10个His喔 3.实验准备上的问题 你的column用了多次的话就应该要re-charge,或column中的EDTA或imidazole是否有清洗乾净.再者你的所有buffer是否有会干扰实验的物质,或你的梯度拉的太快,loading时流速过高,都会有所影响喔 4.命不好 其实做蛋白质实验常常会是听天由命的,表现量,纯化结果等等.基本上本人也发身过许多次.但基本上尽力而为罗 -- ※ Origin: 奇摩 大摩域 <http://bbs.kimo.com.tw/> ◆ From: 218.166.130.76