==> sys (none) 提到: > ==> [email protected] (奶酥麵包) 提到: > > 想請教各位高手~~ > > 我用bio-rad的NC paper壓neutrophil的total p38　（antibody是cell signal） > > 壓overnight出來只有弱弱的一條band (protein load的量是５０ug) > > （用同樣的蛋白質量一秒GAPDH就強得不得了） > > 於是我改用Pall corporation的PVDF > > (PVDF用前先泡一下methanol→用三次水wash一下→泡transfer buffer五分鐘。 > > 　之後的過程都沒有讓PVDF乾掉) > > 哇～～～結果壓出來也是弱弱的一條band > > 各位高手幫我想想辦法啊～～～ > 1. methanol rinse過後 直接放transfer buffer > 2. 換新的antibody 或是調高濃度 > 另外 > 很多條件都不清楚耶 > 像是用什麼detect > transfer有沒有注意溫度 > antibody的concentration 也不清楚原本的表現量是否就這麼低，原作是做control麼？ 還是internal control那條band很強，實驗組卻很弱？ methanol rinse後，有沒有用三次水洗過，一般並無太大關係， 不放心的話也可以直接放transfer buffer搖。 另外，transfer出來，可以先觀察一下membrane上面有沒有已經轉過去的band， (這是假設表現量夠多，可以看到一條條的lane之痕跡) 如果轉不太過去，回頭檢討transfer的condition，電壓與時間的設定如何？ (甚至機器有無損壞、buffer有無配錯等等) 如果轉好的band很清楚，但壓出來卻很弱，再考慮其後步驟是否出問題； 例如antibidy活性還在不在？diluted之濃度是否正確？ first antibody是否容易被洗掉還是結合蛋白質之力量很強？ 可看看之前的背景是乾淨的還是有點黑的？太乾淨的話可再檢討顯色和壓片的步驟。 ......可能的問題太多了， 先檢視一下可以改善的步驟會比較容易汰選出真正有問題的地方... 加油... -- 非常寂寞時 才發現你在夢裡 在靈魂裡 下著我最後的細雨 -- ☆ [Origin:椰林風情] [From: sw244-21-246.adsl.seed.net.] [Login: **] [Post: **]