==> sys (none) 提到: > ==> [email protected] (奶酥面包) 提到: > > 想请教各位高手~~ > > 我用bio-rad的NC paper压neutrophil的total p38　（antibody是cell signal） > > 压overnight出来只有弱弱的一条band (protein load的量是５０ug) > > （用同样的蛋白质量一秒GAPDH就强得不得了） > > 於是我改用Pall corporation的PVDF > > (PVDF用前先泡一下methanol→用三次水wash一下→泡transfer buffer五分钟。 > > 　之後的过程都没有让PVDF乾掉) > > 哇～～～结果压出来也是弱弱的一条band > > 各位高手帮我想想办法啊～～～ > 1. methanol rinse过後 直接放transfer buffer > 2. 换新的antibody 或是调高浓度 > 另外 > 很多条件都不清楚耶 > 像是用什麽detect > transfer有没有注意温度 > antibody的concentration 也不清楚原本的表现量是否就这麽低，原作是做control麽？ 还是internal control那条band很强，实验组却很弱？ methanol rinse後，有没有用三次水洗过，一般并无太大关系， 不放心的话也可以直接放transfer buffer摇。 另外，transfer出来，可以先观察一下membrane上面有没有已经转过去的band， (这是假设表现量够多，可以看到一条条的lane之痕迹) 如果转不太过去，回头检讨transfer的condition，电压与时间的设定如何？ (甚至机器有无损坏、buffer有无配错等等) 如果转好的band很清楚，但压出来却很弱，再考虑其後步骤是否出问题； 例如antibidy活性还在不在？diluted之浓度是否正确？ first antibody是否容易被洗掉还是结合蛋白质之力量很强？ 可看看之前的背景是乾净的还是有点黑的？太乾净的话可再检讨显色和压片的步骤。 ......可能的问题太多了， 先检视一下可以改善的步骤会比较容易汰选出真正有问题的地方... 加油... -- 非常寂寞时 才发现你在梦里 在灵魂里 下着我最後的细雨 -- ☆ [Origin:椰林风情] [From: sw244-21-246.adsl.seed.net.] [Login: **] [Post: **]