我以前是做RT-real time PCR 也是用SYBR Green做的~ 我用過PRIMER濃度從100nM~900nM (每家kit建議的濃度不太依樣) 個人覺得濃度越高primer dimer比較嚴重 有時連negative control也會有訊號 我不太喜歡這樣的DATA 在我的實驗中 降低primer濃度只是會讓終產物變少 對過threshold的Ct並沒有影響 不過還是建議每次跑realtime都要放positive/negative control ※ 引述《frela (漫步北台灣)》之銘言： : 您好,我是某公司的產品專員, : 根據敝公司的SYBR Green supermix KIT標準操作手冊中指出, : primer的終濃度一般最好是介於100~500 nM 左右 : 而您文中之意是貴老師認為最好終濃度在500 nM : 而您"不小心"只用了終濃度50 nM : 基本上,若不考慮不同產品的優劣性... : 您用的量,"會不會太少?" : 這個問題...我想很少人可以回答,因為不同的檢體或樣本 : 都有可能有其最佳的條件存在,primer也是一個需要考量的條件, : (比如說primer 的濃度低,是可以有效降低primer dimer的問題... : 不過這是不得已的解決辦法...) : 關鍵在於一般像QPCR這種相當敏感的實驗來說.. : 您的positive control及negative control能不能有效證明您的實驗是合理的, : 才是重點! : 如果之前沒有設定的話 : 您就重新各設定一個positive control及negative control來證明... : 若依我不負責任的說法...我倒覺得根本沒差多少,只是最低濃度的二分之一? : 論文中明確著明方法即可... : ※ 引述《candy315 (沉澱)》之銘言： : : 各位大大好，我是某大學的碩士生 : : 我想請教關於real-time PCR的問題 : : 大部份的實驗...都會用RNA轉cDNA然後再做real-time PCR : : 但我的template是genomic DNA : : 也有聽說genomic DNA的real-time比較不好做.. : : 然後，一個大問題來了 : : 我們老闆說，primer的量通常是總體積的1/10左右 : : 所以我先用一般PCR在測試primer時，我是用5uM的primer，然後每管取2.5ul : : (total volumn為25ul) : : 但做real-time時，因為我陰錯陽差的失誤 : : 一直以來，我都是用5um的primer，然後每管加0.25ul : : (total volumn亦為25ul) : : 我想請問大家，有人用過這麼少量的primer嗎?? : : 因為我的實驗其實已經快結束了...如果我之前的primer量真的加的太少， : : 那我可能所有實驗要重做了....orz : : 所以我想請問各位有經驗的大大，有人也是和我一樣，用類似的量做real-time PCR的嗎 : : PS，我用的kit是 SYBR的kit --

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