我以前是做RT-real time PCR 也是用SYBR Green做的~ 我用过PRIMER浓度从100nM~900nM (每家kit建议的浓度不太依样) 个人觉得浓度越高primer dimer比较严重 有时连negative control也会有讯号 我不太喜欢这样的DATA 在我的实验中 降低primer浓度只是会让终产物变少 对过threshold的Ct并没有影响 不过还是建议每次跑realtime都要放positive/negative control ※ 引述《frela (漫步北台湾)》之铭言： : 您好,我是某公司的产品专员, : 根据敝公司的SYBR Green supermix KIT标准操作手册中指出, : primer的终浓度一般最好是介於100~500 nM 左右 : 而您文中之意是贵老师认为最好终浓度在500 nM : 而您"不小心"只用了终浓度50 nM : 基本上,若不考虑不同产品的优劣性... : 您用的量,"会不会太少?" : 这个问题...我想很少人可以回答,因为不同的检体或样本 : 都有可能有其最佳的条件存在,primer也是一个需要考量的条件, : (比如说primer 的浓度低,是可以有效降低primer dimer的问题... : 不过这是不得已的解决办法...) : 关键在於一般像QPCR这种相当敏感的实验来说.. : 您的positive control及negative control能不能有效证明您的实验是合理的, : 才是重点! : 如果之前没有设定的话 : 您就重新各设定一个positive control及negative control来证明... : 若依我不负责任的说法...我倒觉得根本没差多少,只是最低浓度的二分之一? : 论文中明确着明方法即可... : ※ 引述《candy315 (沉淀)》之铭言： : : 各位大大好，我是某大学的硕士生 : : 我想请教关於real-time PCR的问题 : : 大部份的实验...都会用RNA转cDNA然後再做real-time PCR : : 但我的template是genomic DNA : : 也有听说genomic DNA的real-time比较不好做.. : : 然後，一个大问题来了 : : 我们老板说，primer的量通常是总体积的1/10左右 : : 所以我先用一般PCR在测试primer时，我是用5uM的primer，然後每管取2.5ul : : (total volumn为25ul) : : 但做real-time时，因为我阴错阳差的失误 : : 一直以来，我都是用5um的primer，然後每管加0.25ul : : (total volumn亦为25ul) : : 我想请问大家，有人用过这麽少量的primer吗?? : : 因为我的实验其实已经快结束了...如果我之前的primer量真的加的太少， : : 那我可能所有实验要重做了....orz : : 所以我想请问各位有经验的大大，有人也是和我一样，用类似的量做real-time PCR的吗 : : PS，我用的kit是 SYBR的kit --

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