: 推 ggg12345: Illumina的那篇文章裡提到ATCG合成時,也可能出錯,聚合酶 11/20 21:27 : → ggg12345: 會改正解開,交大的實驗是因為Mg稀釋到很低,所以不發生這 11/20 21:35 : → ggg12345: 種過度快速反應,所以沒量出錯配再解開的導電波形嗎? 11/20 21:37 : 推 jabari: Pol會不會作錯跟他心情有關..改正跟Klenow有關 Mg只是動力 11/21 00:12 : 推 ggg12345: 請問那個Mg最後跑到那去了?是否有其他代用品? 11/21 02:26 老師，之前講的是簡單版 (想說您不是做蛋白質結構的) PCR 反應中，鎂離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用，並且催化聚合酶。 看圖比較容易懂: http://www.jbc.org/content/274/25/17395/F3.expansion.html 詳細版的聚合酶作用步驟可以參考 Critical role of magnesium ions in DNA polymerase beta's closing and active site assembly 這篇 2004 年 paper 的最 末段 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15238001 )，就可以看到 PCR 反應 過程為什麼緩衝液中一定要有鎂離子（濃度一般會在 0.5-5mM 之間。<1.5mM 產量會 降低，>2.5mM 會開始出現 nonspecific 的結果，>10mM 會抑制聚合酶作用。) Taken together, we suggest the following sequence in pol beta's reaction pathway for correct nucleotide insertion: (1) binding of the dNTP/Mg2+ association to the pol beta/DNA in an open state; (2) binding of the catalytic Mg2+ to the active site; (3) relatively fast conformational transition from an open to a closed state involving subtle residue motions; (4) slow, and possibly rate-limiting, assembly of the key amino acid residues, template bases, Mg2+ ions, and the primer 3’-OH; (5) slow and possibly rate-limiting chemical step of the nucleotidyl transfer reaction; (6) release of the catalytic Mg2+; (7) relatively fast conformational transition from the closed to open complex state again involving subtle residue motions; (8) release of the product PPi/Mg2+ unit. Steps 1 and 2 may be interchangeable depending on which Mg2+ first binds to the polymerase/DNA active site. 不管接上去的是對的還錯的 dNTP (帶負電)，都需要鎂離子幫忙穩定雙股 DNA。看圖 還是比較容易懂：http://goo.gl/93VMFd 只是接到對的 dNTP 整個 DNA 聚合體能量 會比較穩定、接到錯的 dNTP 整個 DNA 聚合體能量會比較不穩定，可參考 2008 年這 篇 Mismatched and matched dNTP incorporation by DNA polymerase beta proceed via analogous kinetic pathways 第 11 圖: http://goo.gl/DaoVF1 所以我個人對 Fig.S7 將 10mM 的鎂離子稀釋 10**6 倍後才會出現的量測圖形的看法， 傾向於那是機器的背景值 (← 就像示波器或 UPLC 開機就一定會有背景值一樣)，因 為鎂離子濃度這麼低的情況下，聚合酶應該也不太活動了。 老師您如果很喜歡這個定序概念，請看一下 Nature Nanotechnology 在 2007 年就已 出刊的 Sequence-specific detection of individual DNA polymerase complexes in real time using a nanopore. UC Santa Cruz 這團隊用同樣的技術一直持續產出 paper，到現在。 交大團隊還 UC Santa Cruz 團隊的實驗數據可信，時間會說話。 最後，生物體內有很多很多酵素，需要鎂當催化劑的並不只有 PCR 反應的聚合酶。 "有沒有其他替代物" 這問題，雖然我沒辦法做任何結構生物學實驗，不過根據土法煉 鋼自己配 buffer 一個一個試的結果：鋅、銅、錳、鈣、鎳、鐵好像都 OK (← 就實 驗室裡找得到什麼會被 EDTA 無效掉的東西就拿去配 buffer 跑跑 PCR 測試一下) --

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