: 推 ggg12345: Illumina的那篇文章里提到ATCG合成时,也可能出错,聚合酶 11/20 21:27 : → ggg12345: 会改正解开,交大的实验是因为Mg稀释到很低,所以不发生这 11/20 21:35 : → ggg12345: 种过度快速反应,所以没量出错配再解开的导电波形吗? 11/20 21:37 : 推 jabari: Pol会不会作错跟他心情有关..改正跟Klenow有关 Mg只是动力 11/21 00:12 : 推 ggg12345: 请问那个Mg最後跑到那去了?是否有其他代用品? 11/21 02:26 老师，之前讲的是简单版 (想说您不是做蛋白质结构的) PCR 反应中，镁离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用，并且催化聚合酶。 看图比较容易懂: http://www.jbc.org/content/274/25/17395/F3.expansion.html 详细版的聚合酶作用步骤可以参考 Critical role of magnesium ions in DNA polymerase beta's closing and active site assembly 这篇 2004 年 paper 的最 末段 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15238001 )，就可以看到 PCR 反应 过程为什麽缓冲液中一定要有镁离子（浓度一般会在 0.5-5mM 之间。<1.5mM 产量会 降低，>2.5mM 会开始出现 nonspecific 的结果，>10mM 会抑制聚合酶作用。) Taken together, we suggest the following sequence in pol beta's reaction pathway for correct nucleotide insertion: (1) binding of the dNTP/Mg2+ association to the pol beta/DNA in an open state; (2) binding of the catalytic Mg2+ to the active site; (3) relatively fast conformational transition from an open to a closed state involving subtle residue motions; (4) slow, and possibly rate-limiting, assembly of the key amino acid residues, template bases, Mg2+ ions, and the primer 3’-OH; (5) slow and possibly rate-limiting chemical step of the nucleotidyl transfer reaction; (6) release of the catalytic Mg2+; (7) relatively fast conformational transition from the closed to open complex state again involving subtle residue motions; (8) release of the product PPi/Mg2+ unit. Steps 1 and 2 may be interchangeable depending on which Mg2+ first binds to the polymerase/DNA active site. 不管接上去的是对的还错的 dNTP (带负电)，都需要镁离子帮忙稳定双股 DNA。看图 还是比较容易懂：http://goo.gl/93VMFd 只是接到对的 dNTP 整个 DNA 聚合体能量 会比较稳定、接到错的 dNTP 整个 DNA 聚合体能量会比较不稳定，可参考 2008 年这 篇 Mismatched and matched dNTP incorporation by DNA polymerase beta proceed via analogous kinetic pathways 第 11 图: http://goo.gl/DaoVF1 所以我个人对 Fig.S7 将 10mM 的镁离子稀释 10**6 倍後才会出现的量测图形的看法， 倾向於那是机器的背景值 (← 就像示波器或 UPLC 开机就一定会有背景值一样)，因 为镁离子浓度这麽低的情况下，聚合酶应该也不太活动了。 老师您如果很喜欢这个定序概念，请看一下 Nature Nanotechnology 在 2007 年就已 出刊的 Sequence-specific detection of individual DNA polymerase complexes in real time using a nanopore. UC Santa Cruz 这团队用同样的技术一直持续产出 paper，到现在。 交大团队还 UC Santa Cruz 团队的实验数据可信，时间会说话。 最後，生物体内有很多很多酵素，需要镁当催化剂的并不只有 PCR 反应的聚合酶。 "有没有其他替代物" 这问题，虽然我没办法做任何结构生物学实验，不过根据土法炼 钢自己配 buffer 一个一个试的结果：锌、铜、锰、钙、镍、铁好像都 OK (← 就实 验室里找得到什麽会被 EDTA 无效掉的东西就拿去配 buffer 跑跑 PCR 测试一下) --

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