这是 http://lab.ac.ntu.edu.tw/plantlab/images/FinalExam_b91603116.doc 的 HTML 档。 其中被广泛用在植物的系统就是组织培养，可以不同的培植体方式进行种原的储存(如： 种 子、花粉、孢子、DNA…等)，而所得到的培植体大致上配合以下重点方式，来进行种原保 存： 减缓生长(slow growth method)： 控制温度约1~4℃ 减少光照 低氧环境 控制荷尔蒙含量：succinic acid 2,2-dimethyl hydrazide(B-9), cycocel(CCC) 和 abscisic acid(ABA)均能有效减缓生长 添加渗透压抑制剂(osmotic inhibitor)：3~6%的mannitol或高浓度的sucrose添加入培养 基中，可减缓生长 超低温保存技术(cryopreservation)： ˙将贮藏温度降至-20℃以下，可称为低温贮藏；在此温度下，种子的贮藏多须密封在容 器内，除非是贮藏设备已极为完善，达到能自动调节湿度并能长时间保持恒温及恒湿，则 种子不须密封於容器内。所谓的极低温贮藏是将种子贮藏在液态氮温度 (约-196℃)或更 低的温度，甚至於在绝对温度下贮存，而仍能保持其发芽能力，最主要的是他们能耐严重 脱水或极端的抗寒，但是潮湿种子经常会因轻度冷冻而死亡，除非他们能在寒冷气候中越 冬；种子的含水量在15%以下，即使在极端低温(约-271℃)种子也不会受到损害；而在正 常脱水状态下，植物细胞浸到液态氮中，只要降温後再回暖的速度控制得宜，还是能够成 活；有关此种降低温到液态氮温度仍能成活的因素到目前为止仍不是很清楚。 ˙用液态氮的极低温处理且能获致最高的种子发芽率的程序应为： 1先将种子乾燥至含水量为乾重基础的8-15 %. 2.将种子封入铝箔袋或放入螺旋盖密闭的铝制或塑胶制的容器内。 3.把盛有种子的铝箔袋或容器从室温浸入液态氮内贮藏﹒ 4.贮藏後，欲使用时，把铝箔袋或容器取出，回温至0℃或室温条件下慢慢回温。 以下分别介绍之： A. 种子型种原保存 ◎种子库 ˙步骤如下： 1.利用Seed collecting nets或是利用直升机收集瓦勒迈杉的种子 Seed collecting nets Seed collecting with a helicopter 2.将种子乾燥，使其水分含量降至5~8 % of dry weight ，减少水分含量(低湿度)可以使 呼吸作用变慢，减缓老化，延长活性 3.种子置入贮藏库中，进行低温种原保存。其储存温度的控制因素有二：适合的冷冻柜造 价及期望的种子寿命。极低温 或许允许种子生存好几个世纪，但在大多数的例子中，因价格太高而被排除，大多数 种子的贮藏温度在-10℃至-20℃之间，但有些种类可以高至-5℃。使用较简单的系统， 省下来的经费可以用来研究异储型(recalcitrant)的种子─那些不能以简单方法保存的种 子。 [补充] ˙长期贮藏库的温度是摄氏零下12±2度，相对湿度是30±3％。在这环境下，种子寿命可 达30?50年，贮藏容量24万份，种原须经严格监定及评估才能入库永续保存。 ˙中期贮藏库的温度是摄氏 1±2度，相对湿度是40±3％，贮藏容量25万份。这贮藏库贮 藏常用种原，供交换、繁殖与评估之用。 ˙短期贮藏库的温度是摄氏10±2度，相对湿度是40±3％，专供贮藏经常取用的种原，如 育种材料的亲本或後裔，以及具有特殊性状的研究材料。这贮藏库也供国内科学家申请寄 存他们的研究材料。 4.以贮藏库方式运送至世界各地 B. 非种子型种原保存 ◎花粉库或孢子库 ˙使用花粉或孢子来保存种原的优点： 1.花粉粒子甚小，数千个或上万个的花粉粒可贮存在一个很小的容器内。 2.能很容易得到最大的歧异度。 3.花粉可用於育种学，尤其是人工授粉时，更是不可或缺的。此常用於亲代花期不同或不 同地区杂交时，均须使用贮藏花粉。 4.植物如有自花不授粉的，异花的开花期又不一致；则可将花粉贮存，俟其他的花开後， 再进行授粉。 ˙使用花粉或孢子来保存种原的缺点： 1.花粉或孢子的贮藏期比种子短，最长的花粉贮藏期不过数年而已，目前已知贮藏最久的 花粉为苹果的花粉，在-20℃下贮藏可达9年之久。 ˙步骤如下： 由新鲜的花取得花粉或孢子 乾燥花粉或孢子。控制湿度：在空气中相对湿度低，对花粉存活力有益，一般言之，相对 湿度为10-30%时，花粉的存活力能保持得最久;如更低，则会影向花粉的类脂酸自动氧化 ，而减弱活力，一些存活期特别短的花粉，如禾本科的植物即使是在轻度乾燥也不能忍受 ;如玉黍蜀的花粉在相对湿度50%以下便逐渐失去活力。 控制温度：贮藏温度低对花粉的活力保存有正面的影响，可利用极低温贮藏 (cryopreservation)，如：置於液态氮(-196℃) 通入二氧化碳：大气中的氧气由於能促使氧化作用的进行，因而对花粉的贮藏不利，反之 ，二氧化碳常能阻止氧化作用的进行，对花粉的贮存有利。 避免光照：将花粉暴露於阳光下，不利於花粉的贮藏，尤其是紫外线及放射线对花粉的活 力影向尤其大。 ◎染色体DNA库 生物技术，可能在未来几年之後将大大改变基因库的本质，为最具保存种原多样性潜 力的方式。以DNA 片段为保存体，可以被重组或放大做为植物育种之用。目前这些生物技 术能成功地直接应用於保存种原的例子相当的少，一方面限於成本过於昂贵，另一方面则 必需对物种的发育机制与遗传结构有更深入的了解，才能期望利用这些技术来保存种原之 多样性。 ◆【问题二】请运用组织培养方法，增加瓦勒迈杉的基因变异，并选出可以种在寒带的杉 苗？ Ans： A.利用 诱变育种 (induced mutation breeding) 方式增加基因变异： ˙诱变育种为产生遗传变异及重要基因选殖之良好工具，其目的主要为：提高产量、改进 产品质量、产生新的生物活性物质。整个诱变育种的基本过程为：植株 → 诱变 → 初筛 → 复筛 → 放大 → 获得优良变异株。其中又以诱变（induced mutation）和筛选（ screening）为最重要的两个环节。在诱变育种过程中，有几个原则须注意： 1.诱变剂的选择：简便有效 2.诱变剂的种类：物理诱变剂，化学诱变剂，拟辐射物质（radiomemetic chemical ） 3.诱变剂量的选择：存活率或死亡率曲线，剂量-诱变率曲线 ˙诱变方法： 1.物理因素：利用放射线照射诱发突变，如γ射线、钴六十 2.化学因素：化学诱变剂 (如秋水仙素、硫酸二乙酯 、乙烯亚胺、羟胺等化学药剂)，诱 发遗传物质产生突变，而可加以利用。 ˙所得诱变物种的利用： (1) 直接法: 诱发突变後，直接加以固定作为品种利用，一般多为既有之优良品种诱得优 良性状後加以利用。 (2) 间接法: 诱变结果多伴有恶劣因子，故多以突变体为杂交材料，以育成优良品种。 ˙由於诱变可获得大量之变异，若以植株选拔，需要大面积土地及劳力。若使用细胞培养 选拔，可於小规模之室内进行试验。(除细胞外，癒伤组织、花药、原生质体都可诱发突 变) 但有下列问题需待解决： 1.若要选拔隐性突变因子，须以单倍体培养。 2.需寻找及建立单细胞分离、原生质培养及单细胞再分化为植株的有效方法。 3.由於须在细胞阶段选拔，故须找出在细胞培养即可选拔之性状。 利用以上诱变方法得到的突变细胞，分化成植株，进行耐寒试验，最後再转入田间，进行 田间试验，通过有性世代使遗传性稳定下来，最後获得耐寒性的杉苗。 B.利用体细胞杂交(somatic hybridization)方式增加基因变异： 利用与瓦勒迈杉亲源相近的耐寒物种(如：智利南洋杉，其为南洋杉属中唯一耐寒的树 种，可耐－17℃ 的低温，而且又与瓦勒迈杉同科，较不易出现杂交不和合的现象)，与瓦 勒迈杉进行原生质体融合，藉由加入适当fusogen (如：sodium nitrate，polyethylene glycol)，接受外来遗传物质，包括DNA片段、粒线体、叶绿体，甚至细胞核等，以达到基 因转移目的，得到somatic hybrid，使转移进来的基因於再生植株中表现，在进行耐寒性 试验，筛选出耐寒性的杉苗，最後再进行田间试验。 ˙步骤如下： 1.分别取出瓦勒迈杉以及智利南洋杉之花粉 2.分别取得花粉原生质体：将花药切开→取出花粉→置於在含有酵素和渗透压稳定剂的溶 液中→培育→原生质体沉到培养皿底部→除去酵素溶液→将原生质体移入CPW清洗→离心 →清洗基质两次→重新悬浮於培养基→除去小的个体，用血球计计数→调整到合适的密度 重悬浮於培养基。 3.进行原生质体融合：利用PEG法(Polyethylene glycol)，分别取在含有13％甘露醇的 CPW上悬浮培养的原生质体（密度2×105）4mL，混和在100g的转速下离心10mins，将原生 质体放入0.5％基质→加入30％（w/v）PEG 2mL，使原生质体的外膜不稳定，放置10min→ 每隔5min加入原生质体培养基稀释PEG以促进原生质体融合。每次稀释後轻微摇动原生质 体就会重悬浮→混和物在100g下离心10min，离心後在不含PEG的培养基中清洗→离心，在 相同的培养基上重悬浮 4.将融合之原生质体接种到适当的选择性低温培养基，进行耐寒性筛选，选择出具有抗寒 性的原生质体，进行原生质体培养。 5.增殖分化生成抗寒性瓦勒迈杉植株幼苗 C.利用基因转植方式增加基因变异： 1. 将耐寒性基因 (如：北极鱼的耐寒基因、阿拉伯芥中分离 glycerol-3-phosphate acyltransferase 基因)利用以下基因转殖方法，移入瓦勒迈杉的基因体上 ◎直接转殖 (Direct DNA delivery) 1. 微量注射法 (Microinjection) 2. 电穿孔法 (Electroporation) 3. PEG-mediated gene transfer 4. 基因枪法 (Microprojectile bombardment, Gene gun) 5. 花粉管法 (Pollen tube pathway) ◎非直接转殖 1. 农杆菌法 (Agrobacterium-mediated transformation) 2. 病毒法 (Virus vector) 2. 利用抗寒性试验，筛选出成功将耐寒基因转殖到瓦勒迈杉中的细胞。 3.大量培养、诱导分化生成植株， 4.进行田间试验，获得遗传性稳定的耐寒植株。 ◆【问题三】在利用组织培养使其幼胚发展根系的初步试验，发现添加IAA的效果不佳。 请讨论效果不佳的可能原因为何？如何解决？ Ans： 目前已知Auxin对茎及叶柄的延长有助益，但是也有可能抑制根的生长；而这种促进 或抑制的作用受到五种因素的影响： 1.组织或是器官的生长阶段 2. Auxin的浓度 3. Auxin的种类，天然或是合成的 4.与其他荷尔蒙之间的作用 5.组织为切除下来的或是在活体内的。 以下分别讨论之： 组织或是器官的生长阶段 胚在整个发育过程中，会经历不同的生长阶段(stage I → stage II→ stage III)，在 不同的发育阶段，胚所需要的营养成分组成以及含量都会有所不同(如附注)，因此IAA效 果不佳的原因，可能是因为当时胚所处的生长阶段，并不需要IAA，故添加IAA反而导致根 系发展受到抑制。 解决方法： 正确的了解胚所处的发育生长阶段，添加适合他的培养基成分。 Auxin的浓度 一般来说，生长素(IAA)对营养器官纵向生长有明显的促进作用。如芽、茎、根三种 器官，随着浓度升高，器官伸长递增至最大值，此时生长素浓度为最适浓度，超过最适浓 度，器官的伸长则受到抑制。 不同器官的最适浓度不同，茎端最高，芽次之，根最低。由次可知，根对IAA（生长 素）最敏感，极低的浓度就可促进根生长，最适浓度为10-10M。茎对IAA敏感程度比根低 ，最适浓度为10-５M。芽的敏感程度处於茎与根之间，最适浓度约为10-８M。所以能促进 主茎生长的浓度往往对侧芽和根生长有抑制作用。 正由於根对IAA的敏感度最高，因此对於根系的发展，IAA的浓度便显得很重要，如同 上点所述，组织或器官在不同的发育生长期时，所适合的最适浓度都不一样，因此加入 IAA效果不佳的原因，可能是因为当时所需的IAA浓度不对所造成 解决方法： 正确的了解胚所处的发育生长阶段，添加适当浓度的IAA。 Auxin的种类，天然或是合成的 IAA由於是植物天然活性成分，故很不稳定，容易见光而分解，因而造成IAA效果不佳。 解决方法： 1.使用人工合成、性状较稳定的NAA，利用NAA制成”生根粉”。 但NAA具有一定的特 异性，即仅对具有NAA转化酶的植物起作用。 2.使用市售广效型生根粉，例：ABT系列生根粉。 3.加入活性碳於培养基中。 与其他荷尔蒙之间的作用 IAA与其他荷尔蒙之间会有相互的影响作用，如下 ˙[IAA] = [CK] (细胞分裂素)→生长，细胞不分裂 [IAA] > [CK] → 根生长 [IAA] < [CK] → 茎生长 ˙ABA和IAA以及Gibberellin拮抗 可能是因为IAA浓度小於或等於cytokinin，使根的生长受到抑制；或是植物处在逆境时， 使植物体产生过多ABA，用以拮抗IAA的作用，使得IAA的效果不彰 解决方法： 控制其他荷尔蒙的量，让他们和生长素之间的作用达到促进根生长的平衡 组织为切除下来的或是在活体内的 基本上，在活体中，生物体正常的生理反应机制能有效的发挥IAA的效用；但若因为组织 培养所切除下的培植体(本题为embryo)，其不具有系统的机制来进行荷尔蒙的调控，因此 使得在培养时，常会出现一些recalcitrance的现象，造成IAA对培植体的效果不彰。(?不 确定?) 解决方法： 确实了解引起recalcitrance的因素，并且加以改善 ◎其他可能原因： ˙培养操作过程： 1.氧浓度太低。例： 降低浓度促进胡萝卜癒伤组织芽的形成，增加氧浓度促进不定根形成。 乾长根，湿长芽。 ˙根和胚芽鞘的生长所要求的含氧量不同。根的生长，包括细胞的伸长和扩大，及细胞分 裂，而细胞分裂需要有氧呼吸提供能量和重要的中间产物。因而水多、氧不足时，根的生 长受到抑制。但是胚芽鞘的生长，主要是细胞的伸长与扩大，在水层中，水分供应充足， 故而芽生长较快。 ˙与生长素含量有关。在水少供氧充足时，IAA氧化酶活性升高，使IAA含量降低，以至胚 芽鞘细胞伸长和扩大受抑制，根生长受影响小。而在有水层的条件下，氧气少，IAA氧化 酶活性降低，IAA含量升高，从而促进胚芽鞘细胞的伸长，并且IAA运输到根部，因根对 IAA比较敏感，使根的生长受到抑制。 解决方法： 增加氧浓度。 2. 培养基中营养不足或有毒代谢物的积累。 解决方法： (1)定期subculture到新鲜的培养基上。 (2)加入活性碳吸附有毒物质。 ˙外在环境 光线波长不恰当或过亮。 例：蓝光有利於芽的分化，而红光、远红光对芽分化有抑制作用，但促进根分化，紫光 对生芽有刺激作用。 解决方法： 调整成促进生根的光线 (红光、远红光)。 加入活性碳至培养基中。 2. 培养温度过低或过高。 解决方法： 调整至适合根系生长的温度。例：胡瓜的根系生长适温是22-25℃。 研究控制基因表现的分子机制 ˙步骤如下： 利用已知的基因序列定出上游的control sequences(包括enhancer和silencer)以及 promoter 把包含control sequences、promoter以及该基因序列选殖出来，insert到特定plasmid ( plasmid I ) 的multiple cloning site 转殖到competent cell，观察该酵素表现的情形 将上述表现型研究所获得的特定成分的基因序列定出，并选殖出来，insert到特定的 plasmid ( plasmid II ) 将plasmid I和plasmid II同时转殖到competent cell，另以一组同时转殖plasmid I和不 含 insert 的plasmid II当作对照组 以PCR检测各组酵素表现的情形，从酵素表现的异同，判断该特定成分对於基因的调控作 用 进一步了解讯息传递 可将该特定物质打入细胞，观察该物质加入後时间对该酵素表现的情形，若在此物质 打入细胞的初始，酵素立即大量表现，则此物质可能是直接影响该酵素的表现；但若此物 质打入後，并未立即发生酵素表现，经过一段时间才表现，那此物质可能是间接影响酵素 的表现，中间可能经过一联串的梯瀑反应(cascade)。这其中可能是protein-protein interaction所进行的复杂调控机制，详细的调控可能需要更进一步的复杂研究技术。 【补充—认识瓦勒迈杉】 瓦勒迈杉的叶片化石就像其他植物化石一样，可依据叶脉、气孔、细胞等特徵，判断 属於南洋杉科的裸子植物，至於和哪些现生种类相近，则有待更多其他部分的化石被发现 。 Fossil of Wollemi Pine Mature foliage 1994年9月10日，大卫诺柏在瓦勒迈国家公园（Wollemi National Park）（雪梨西北 方蓝山山脉）健行，当他走到一处陡峭的岩壁时，突发奇想利用攀岩垂降到这个岩壁的谷 底，意外发现一些外貌奇特的古老树群；身为野外工作者，大卫很自然地收集了一些枝条 与叶子，带回去请求监定。该中心及雪梨皇家植物园（Royal Botanic Garden, Sydney） 研究人员再度前往该地采集了更多的样本，经过详细比对及监定，除了发现这种植物其实 已经有化石的纪录（且仅仅有化石的纪录）外，并依据叶子形态、叶脉及球果等特徵判断 ，该种植物应归类在现生植物中的南洋杉科（Araucariaceae）。 原本现存的南洋杉科植物有两个属—贝壳杉属（Agathis）及南洋杉属（Araucaria） ，而此种植物特徵明显可以和此二属区别，所以必须成立一个新属。当各种资料都显示此 一物种为新分类群时，1995年由三位学者依发现的地点给与「属」的命名，并以发现此植 物「大卫诺柏」先生的「姓」作为本植物的「种小名」。拉丁化以後，本物种的正式学名 即为—Wollemia nobilis W.G. Jones, K.D. Hill & J.M. Allen，英文名称是Wollemi Pine；而为了国人方便称呼，音译为瓦勒迈杉。 瓦勒迈杉是一常绿大乔木，树干直立，在环境不佳时会由基部长出许多分枝；树皮棕 褐色，有许多小瘤状突起。嫩叶浅绿色，对生排列平面生长，随着叶片的成熟，除了颜色 加深变暗外，更会转成立体排列，同时枝条也开始分岔成二列 。瓦勒迈杉是雌雄同株异 花，往往是雄花先开了以後雌花才形成；雄花一般位置较低，呈圆棒状；雌花子弹形着生 於枝条末端，呈浅绿色。雌花授粉後渐渐膨大，果鳞随之变长，且颜色渐转深呈暗绿。据 悉，一枚球果由授粉後到成熟开裂，至少需要2至3年。 Male Cone Micro propagation 经在苗圃实验後，发现瓦勒迈杉的繁殖除了可经由种子发芽繁殖外，组织培养的瓶苗 也很容易生长，扦插的植株更能培养出各类型的苗木；加上野外研究调查的资料及苗圃育 苗的资讯，发现影响瓦勒迈杉生长的速率主要是阳光及土壤，在阳光充足及酸性的土壤中 ，幼株可以一年50公分、成株则是150公分的速率生长。瓦勒迈杉对温度的「耐性」更是 惊人，在零下5至40摄氏度间都还可以存活，但是生长速率及一些形态却会随之调整，例 如改变叶子的颜色或停止生长，这也是为什麽在野外虽然还有瓦勒迈杉的族群（约100株 ），但是经过数百年的生长，最高者也才40公尺左右！因为这里每天只有十分之一的阳光 照得进来，换句话说即使在夏天白日较长，照射时间也不到1.5小时；而有些植株因为环 境实在恶劣，竟然可以停止生长达100年之久！ 为了要保育瓦勒迈杉这片森林，澳洲政府几乎完全封锁该地区，不过由於培育有成， 将於今年至明年间对国际全面开放，届时除了推广这种可以长在户外庭院、室内植栽、地 被灌丛、盆景装饰等多用途的植物，所得经费更可进一步做为瓦勒迈杉，及其他稀有濒危 物种的相关研究及保育工作。 -- After black clouds, clear weather. --

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