作者a9044831108 (yoyo)
看板Biotech
标题WB的问题
时间Sat Jan 6 14:35:35 2024
很久没有做了,这几天做了2次,都是上了ECL肉眼可以看到band,但冷光仪完全照不到,
请各位大大解惑
https://i.imgur.com/gNChHyL.jpg
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1F:→ Bows: protocol 没拿出来是要通灵吗,我通灵一下应该是一抗或二抗01/06 16:10
2F:→ Bows: 太浓01/06 16:10
3F:→ florasflanaa: ECL肉眼可以看到bend就烧掉了吧01/06 17:09
4F:→ florasflanaa: 你蛋白下多少?一二抗的浓度是多少?货号是什麽01/06 17:13
5F:→ florasflanaa: host和size有没有仔细对照过ref.? ECL什麽等级?01/06 17:13
6F:→ florasflanaa: 有没有压过ponceau S和gel stain确认transfer效率01/06 17:15
7F:→ a9044831108: Sample的蛋白质浓度不确定,胶是用10 well,每个load01/06 20:47
8F:→ a9044831108: 20ul,现在用60V跑,再用90V跑,transfer用90V 80mi01/06 20:47
9F:→ a9044831108: n,Blocking 用5% milk 室温1hr,1抗:CD-80(gtx0426001/06 20:47
10F:→ a9044831108: )1:1000 in 5%milk,4度overnight,2抗:rabbit(无货01/06 20:47
11F:→ a9044831108: 号)1:5000 in 5%milk,室温1hr,ECL(没记货号之後01/06 20:47
12F:→ a9044831108: 补充)01/06 20:47
13F:→ a9044831108: 之後strapping ,Blocking,1抗:GAPDH(abcam) 1:100001/06 20:47
14F:→ a9044831108: in 5%milk,4度overnight,2抗:mouse(无货号)1:10001/06 20:47
15F:→ a9044831108: 0 in 5%milk01/06 20:47
16F:→ a9044831108: 之前另外一位有跑出来,冷光仪有照到,但我是什麽都 01/06 20:48
17F:→ a9044831108: 没照到,肉眼就看得到band01/06 20:48
18F:→ a9044831108: 太久没做,不确定是不是哪个没配好01/06 20:48
19F:推 ysfang623: 先确定冷光仪操作有没有问题,sample能不能序列稀释?01/08 23:27
20F:→ ysfang623: 还有internal control 有没有讯号01/08 23:27
21F:推 cyc5566: 肉眼可见,大概几秒就烧掉了01/09 16:31
22F:→ xxtomnyxx: 有一个很蠢但我还真看过有人发生的可能...... 01/09 19:03
23F:→ xxtomnyxx: 1抗 and/or 2抗完没有wash就直接加ECL.....01/09 19:04
冷光仪操作没有问题,sample的量是照着前人load,重点是internal control也照不出来
,每个1抗跟2抗之间都有wash。後来二抗有调整浓度,改1:10000,也完全照不到,肉眼
都看得到,Protocol都是照着前人的,现在已经做到不知道哪里有问题了
01/10 11:52
※ 编辑: a9044831108 (223.137.114.160 台湾), 01/10/2024 11:57:51
24F:→ blence: 我想猜冷光仪,因为冷光仪已经可以可见光拍,没必要另开手机 01/10 22:00
25F:→ blence: 而且我有超过一整年没做WB,冷光拍要切换直接忘掉了 01/10 22:03
26F:推 florasflanaa: 你是说同时间做有人跑出来你没有,还是时间有间 01/11 23:46
27F:→ florasflanaa: 隔?有间隔的话也可能有东西过期坏掉,去跟隔壁 01/11 23:46
28F:→ florasflanaa: 实验室借sample和抗体当postive做看看,至少 01/11 23:46
29F:→ florasflanaa: internal ctrl要出来确定你的手法和仪器操作没问 01/11 23:46
30F:→ florasflanaa: 题,然後才能从材料检讨 01/11 23:46
31F:→ florasflanaa: ECL最好也先跟别人借用 01/11 23:49