作者o81628 (yuang)
看板Biotech
标题[求救] 肿瘤冷光讯号消失
时间Sun Sep 24 00:43:56 2023
（手机排版伤眼很抱歉）
各位前辈们晚上好
小弟欲分析材料的抗癌效果,因此转染了冷光基因到癌细胞并打入小鼠体内,结果讯号大概
在第三周消失了QvQ不知道哪个环节出问题希望大家救救我！
以下提供作法
Plasmid: pGL4.1-Luc2(Neo)
Transfection reagent: Lipofectamine 3000
Cell line :K7M2 (mouse osteosarcoma)
Step1. 3*10^4 cells/well in 24 well plate
Step2. 依据protocol, 500ng DNA per well, reagent跟plasmid用Opti-MEM混合均匀後
加回到细胞转染24hr
Step3. G418(500ug/ml)筛选,大概在第三天後细胞有明显飘起来，然後剩下贴附的细胞一
团团聚在一起。就更换成没有G418的medium放大。
细胞继代过程中有取少量细胞做luciferase assay, 讯号约10^6,所以就很放心的继续培
养准备动物实验。
In vivo model: Orthotopic mouse osteosarcoma (intratibial injection)
一只老鼠3*10^5
Luciferin(3mg) , ip, 10min後上机拍摄 （细胞有先照过ivis,10min的讯号是最高峰）
癌细胞打入体内後1-2周的讯号很明显，但第三周开始就有小鼠的冷光讯号消失,但鼠鼠们
的腿明显肿起来,也就是说冷光酵素不再表现了吗?
请问各位前辈们我整个转染到动物实验的环节有哪一部分是做错的或是要再重新调整的吗
？ 我这个plasmid应该是属於Stable transfection对吗？ 以及stable transfection後
细胞一定会永远表现嵌入的基因吗？
这个作法我目前有用在另外两株细胞
1. U87-MG (human glioblastoma)
2. B16F10 (mouse melanoma)
U87在裸鼠脑袋中讯号就很稳定的表现,不过黑色素瘤我打在背部结果跟K7M2也有同样的状
况发生。
实验室以医材为研究方向,老师对这个完全不了解,实验室也只有我一个博班生QvQ实在是
求助无门,希望大家发现到问题能用力的鞭打我～～
在此先非常谢谢各位的帮忙（跪）
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1F：→ xxtomnyxx: 我这个plasmid应该是属於Stable transfection对吗？ 09/24 01:45
2F：→ xxtomnyxx: ↑不对，这种transfection用的vector你没有linearize， 09/24 01:46
3F：→ xxtomnyxx: 放到细胞基本上都是transient transfection，只有极少 09/24 01:47
4F：→ xxtomnyxx: 数会因低机率嵌入genome而变成stable，你应该先挑到 09/24 01:48
5F：→ xxtomnyxx: stable clone 再用它打老鼠 09/24 01:48
6F：→ xxtomnyxx: stable transfection後细胞一定会永远表现嵌入的基因 09/24 01:52
7F：→ xxtomnyxx: ↑不一定，还是有机会被epigenetic regulation 关掉， 09/24 01:53
8F：→ xxtomnyxx: 看你的 Luc 用哪个 promoter 表现，pGL4.1-Luc2(Neo) 09/24 01:54
9F：→ xxtomnyxx: 本身的 Luc 应该没有 promoter 才对吧？你们插了什麽进 09/24 01:55
10F：→ xxtomnyxx: 去表现它？ 09/24 01:55
11F：→ o81628: 您好，这个plasmid是直接买现成并委托放大的，我看了一下 09/24 02:20
12F：→ o81628: 产品说promoter有SV40,HSV-TK及CMV,不知道是否有回答您的 09/24 02:20
13F：→ o81628: 问题 09/24 02:20
14F：→ o81628: 「更正」 我们买的pGL4.51-luc2-Neo含有CMV promoter 09/24 02:39
15F：→ rebirth: 看起来是stable pool不是stable clone，pool是heterogen 09/24 07:56
16F：→ rebirth: eous population ，一群表现量有高有低甚至没表现的混合 09/24 07:56
17F：→ rebirth: 细胞群，或许生长时间久之後这群pool变成只剩下没表现的 09/24 07:56
18F：→ rebirth: 细胞，而没有luc activity 09/24 07:56
19F：→ rebirth: 另外你们selection的时间多久，有确认真的已经是stable 09/24 07:59
20F：→ rebirth: cell line了吗？ luc cassette 真的有insert into host 09/24 07:59
21F：→ rebirth: genome了吗？ 09/24 07:59
22F：→ rebirth: 个人经验是挑选stable clone而非pool，确认已经建立stab 09/24 08:03
23F：→ rebirth: le line，然後放大成MCB冻存与使用 09/24 08:03
24F：→ blence: 搜寻Imanis Life Sciences,如果你们对於建立stable很陌生 09/24 10:31
25F：→ blence: 购买人家建立好Luc, GFP等reporter的细胞可能更有效率 09/24 10:31
26F：→ blence: 另外有人也遇到肿瘤变大IVIS消失的情况,怀疑是每次照之前 09/24 10:36
27F：→ blence: 给的substrate连续几周下来被免疫熟悉後消灭掉了 09/24 10:39
28F：→ o81628: 谢谢大家的指点，看起来我只有stable pool的建立导致整体 09/24 13:06
29F：→ o81628: 细胞的冷光表现不一致。这部分在抗生素筛选後将团聚的细胞 09/24 13:06
30F：→ o81628: 打散稀释到多孔盘中继续筛选，能够长出来的就算是stable c 09/24 13:06
31F：→ o81628: lone吗？ 09/24 13:06
32F：→ o81628: 之後会建议老师购买冷光细胞株QvQ 希望他听得进去 09/24 13:22