作者Netline (没有钱)
看板Biotech
标题[求救] qPCR DDW有值
时间Thu Aug 11 10:28:31 2022
如题，虽然网路上很容易就能找到一堆文章
但照做以後都没改善，找原因找到快发疯QQ
因为身处老板比我更不认识生科技术的环境，小妹又才疏学浅
希望板上大神不吝指教orz
qPCR目标基因分别是动物性基因12S跟植物性基因5.8S
使用Qiagen QuantiNova Porbe PCR kit跑40cycles
跟protocol不一样的是
原厂是建议primer.probe最终浓度0.4μM及0.2μM(duplex分别的浓度)
而实验室目前使用最终浓度为0.7μM及0.2μM(singleplex)
猜测是前人立方法的时候觉得我们只跑一个基因，下浓一点也没关系（？）
但这不知道会不会影响？
水的出值从Ct36-39不等，偶尔也会未检出
目前做过的改善：
pipette拆卸清理，用DNase擦过
primer.probe重配、水重新灭菌
qPCR仪器光学校正
也有想过人员污染，毕竟人就是动物
但现在的情况是植物性基因光P水也会有值………
实在是不晓得哪里还会污染到QQ 希望能够指点迷津
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1F：→ xxtomnyxx: 如果植物性的基因也有Ct，那就未必是污染08/11 12:18
2F：→ xxtomnyxx: 我个人会尝试降低 primer&probe 的浓度，尤其是当有加08/11 12:20
3F：→ xxtomnyxx: 入template的时候Ct都很低的状况(<25，<20尤佳)08/11 12:22
4F：→ xxtomnyxx: 做实验有一个观念，所有的反应都与浓度和温度有关，就08/11 12:23
5F：→ xxtomnyxx: 算是理想上不会发生的反应，只要反应物浓度够高也会发08/11 12:24
6F：→ xxtomnyxx: 生08/11 12:24
感谢回覆！
有加入template的正反应Ct都落在16-18左右
会再跟老板讨论看看，是否可以往这个方向走
现在就是被觉得学理上就算primer.probe浓度比较高也不会影响反应
毕竟没有的东西就是该没有
虽然也知道这逻辑，但毕竟浓度高了两倍感觉变因还是很多 囧
7F：推 jabari: Ct36-39就当NTC cut off不就好08/11 15:19
8F：→ xxtomnyxx: 如果你有加template的样本从来没有超过 25 的 Ct ，那08/11 15:20
9F：→ xxtomnyxx: 把 >35 的通通当 negative 就好，只是万一有出现 Ct 在08/11 15:21
10F：→ xxtomnyxx: 30 上下的样本就不好判读了08/11 15:21
其实我们目前就是把Ct35当判定界线没错
但就是被老板问为什麽水会有值…… 囧
自己以前的学术经验没人会在意Ct值这麽後面的东西
但老板就觉得这样不是办法（？）於是上来讨教QQ
11F：→ jabari: 通常DDW有的话 就是probe品质撑不过你的cycle数 水解了08/11 15:22
12F：→ jabari: 你probe下浓的话 水解掉的量就高 所以CT 36就有. 你还不08/11 15:22
13F：→ jabari: 如拿跑完的产物跑电泳 看有没Band08/11 15:22
实验室没有电泳设备（跪）
不然已经想跑胶肖想很久了……
水解的问题我没想过会影响到，感谢思路！
※ 编辑: Netline (118.160.140.220 台湾), 08/11/2022 23:35:04
14F：推 Ice9: 自从知道有 eDNA的检测和应用之後，我就放开疑惑了。08/14 08:40
环境DNA四处都有就let it go的意思吗？XDDD
15F：→ gundamhaha: 没确定没污染的话就降低primer浓度，缩短annealing时08/15 20:21
16F：→ gundamhaha: 间。根本方法是调整序列08/15 20:21
会再来试看看的！
17F：推 MartianIT: DDW Ct36-39的曲线长怎样? 如果不是sigmoid曲线(e.g.08/17 05:18
18F：→ MartianIT: positive control那种) 而是讯号慢慢增加上飘 应该就是08/17 05:20
19F：→ MartianIT: 杂讯了 最可能的是probe水解掉了08/17 05:21
是那种明显指数增长的曲线
之前也遇过如您叙述的讯号上飘，重配後就有解决
20F：推 BGG: 建议可以找 QIAGEN 专员讨论08/24 14:50
更新一下，也谢谢几位先进的解答
目前做起来比较稳定了，貌似primer真的太浓啦～～
※ 编辑: Netline (223.138.117.94 台湾), 09/02/2022 13:46:32