作者maurice9325 (水色天秤)
看板Biotech
标题[方法] 请问flow做cell cycle 细胞shift分析
时间Wed Jun 22 10:08:59 2022
如题，最近新接触一个药物，加入细胞後24hr再以flow分析cell cycle。
试验流程如下：
1.Seeding 5*10^4/well in 12 well plate.
2.Drug-treated for 24hr.
3.1x Trypsin then collect cell, PBS wash 3 times.
4. 70% EtOH fix for 24 hr at -20 degrees Celsius.
5.PBS wash 3 times.
6.Staining with 20 ug/mL PI, 30ug/mL RNAse, 0.1% TritonX100 at RT 30 min.
7.Flow.
结果因药物影响，造成细胞shift，导致control为基准进行gatting时，结果落差太大，
与实际情形不符。
如附图，以control为基准拉出4个phase，但可看到处理组因shift，S-phase吃到G0/G1-p
hase导致百分比上升，但这个上升是不符合实际情形的。
https://i.imgur.com/iyFMJRA.jpg
https://i.imgur.com/4tiD9Hj.jpg
因此想请问各位因应这种情形会如何分析。
或有什麽改善方法可以方便提供参考，谢谢。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 49.216.131.178 (台湾)
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1F：→ xxtomnyxx: 我猜你的药物会留在细胞内并影响PI染色的萤光06/22 17:45
目前也不清楚，但确实由其他实验推测会影响DNA replication。
2F：推 cjsntu: 直接调整加药组的G0/G1 peak回到跟control一样的位置 不过06/22 20:04
3F：→ cjsntu: 要看老板 有的老师可以接受有的就不行06/22 20:04
感谢回覆。调整peak可能不太行，因为如果范围比较小，例如S-phase怕会有误差，老板
可能不接受。另外就是如果是多浓度/多组别，若每个都要手动，同时得纪录百分比，这
个做法可能不切实际。
※ 编辑: maurice9325 (49.216.131.178 台湾), 06/22/2022 21:03:05
※ 编辑: maurice9325 (49.216.131.178 台湾), 06/22/2022 21:04:27
4F：→ xxtomnyxx: Peak shift 的程度有和给予的药物浓度正相关吗？06/22 22:06
看不出正相关，只知道一定浓度以上即会导致shift。有怀疑过是否与药物处理後pheboty
pe改变所以导致shift，但无法确定。
5F：推 bahrimank: 如果以萤光强度，手动定义G0/G1;S;G2 phase呢?06/22 23:40
有想过，但如同上述，如果每次实验组别太多，会花太多时间在後端分析与记录。且曾经
遇过reviewer挑战，以此方法不够客观，调整不同组别参数以分析自己想要的data也不符
合flow的精神。
6F：推 MartianIT: 药物的MOA是?06/23 00:27
因为是新药开发与测试，所以没有结论。目前就知道会影响DNA的function，如上述DNA r
eplication；而最後一定可以想像细胞就是死了。
另外回覆我们曾经有与专员讨论过，例如：
前段的部分，固定细胞数量後再fix and staining但无效。
或上机时以不同电压微调再收data，但此方法同收完以後再调整有相同的问题，就是一样
组别太多无法操作且不太客观。
或是输出raw image利用第三方软体把shift的位置拉回来叠一起，再进行area的计算，但
我目前没有找到相关软体可以分析。
所以想请问是否有大大有类似的分析经验、或方法上的改善。谢谢。
※ 编辑: maurice9325 (49.216.131.178 台湾), 06/23/2022 07:51:21
7F：→ xxtomnyxx: 既然知道会影响 DNA function，合理假设他会与 DNA 结 06/23 11:37
8F：→ xxtomnyxx: 合，药物分子经常有很多环可以共振，也就有可能会有萤 06/23 11:38
9F：→ xxtomnyxx: 光的性质，我会猜讯号会偏移应该是药物分子的影响，试06/23 11:39
10F：→ xxtomnyxx: 试看换其他种 cell cycle analysis 染剂，或者是在 fix 06/23 11:40
11F：→ xxtomnyxx: 後染 PI 前将所有组别的细胞都用药物处理让他们都有相 06/23 11:41
12F：→ xxtomnyxx: 同的偏移看看(不过药物如果量少又贵就不能这样用) 06/23 11:42
13F：推 darrenyo: 试试看DAPI或hoechst? 还可以不用加RNase06/23 12:51
14F：推 cjsntu: 突然想到PI用到80-100 ug/mL peak shift状况会好很多 我 06/23 21:57
15F：→ cjsntu: 硕班也遇到类似的困扰过 浓度调整之後就有比较好 06/23 21:57
好的，感谢诸位，我会试试看。另若有其他大大另有不同处理/分析方法，仍请不吝提供
。谢谢。
※ 编辑: maurice9325 (49.216.131.178 台湾), 06/24/2022 10:04:41
16F：推 hkaiwei: 要注意每组染色细胞数有没有因为药物处理而改变，会影响 07/29 18:26
17F：→ hkaiwei: 最後PI的强度 07/29 18:26