作者maurice9325 (水色天秤)
看板Biotech
标题[讨论] 定序後找不到cutting site序列
时间Thu Sep 30 08:34:27 2021
各位早，想与各位讨论一个cloning後奇怪的情况。
1. 目的是从A plasmid 把 A insert 以XhoI/XbaI切下来，置换B insert。
A plasmid的 sequence 不清楚 （没有map)，只知道经由双切、gel extraction後约为6k
。
B insert sequence是知道的，以PCR amplification。头尾设计有cutting site sequenc
e，PCR product同样以gel extraction回收，双切後再回收一次，约3.2k。
回收後的vector与insert进行Ligation，并有挑到一个候选的colony。
2. Clone後的plasmid以下述方法确认：
2.1 以XhoI/XbaI双切确认，确实可以得到3.2k 与 6 k的sequence。
2.2 以BamHI单切可以得到得到300多bp 的band (insert中本来就带有两个BamHI的切位，
且确实会掉出300bp片段)。
2.3 以PCR夹确实也可以得到3.2k的band。
因此我就把这个Clone送定序了。
3. 定序时有以B insert序列合成5条Primer，分别如下：
Primer 1: 500 bp 处往回夹
primer 2: 400 bp 往後夹
primer 3: 1100 bp 往後夹
Primer 4: 1800 bp 往後夹
Primer 5: 2500 bp 往後夹
但是定序结果出现了奇怪的问题，也是相与各位讨论的点。
比对结果发现
1.insert的序列完全没错。
2.但是insert 前後，vector的序列都不是XhoI/XbaI的序列。
那为何双切确认时还切得出来。
这个plasmid有可能发生什麽事情吗，或有可能是定序的问题。
请各位提供意见与看法，谢谢。
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1F：→ xxtomnyxx: 基本上，这种问题没提供手上的资料，包含质体序列和定 09/30 09:44
2F：→ xxtomnyxx: 序的结果等等，没资料基本上是不用讨论的，但是可能牵 09/30 09:45
3F：→ xxtomnyxx: 涉到研究内容所以不方便公开，所以......只能自己想罗 09/30 09:46
4F：→ maurice9325: 谢谢楼上，我也想知道质体序列，但就是没有提供。 因 09/30 10:46
5F：→ maurice9325: 可能铺陈太长，就其实只是想问cutting site的sequenc 09/30 10:46
6F：→ maurice9325: e没看到觉得很奇怪。 09/30 10:46
7F：→ blence: 结果在你的primer1,5的图档里,跟你的backbone知不知道无关 09/30 10:59
8F：→ blence: 图档是你的研究内容,这个有公开的疑虑 09/30 11:01
9F：→ ganbaba: 从vector 前後夹回来就知道了阿，基本上定序500bp以後都 09/30 11:08
10F：→ ganbaba: 有可能不准了 09/30 11:08
11F：→ Ice9: 你有看过 primer1,5两个都图档吗？ 是清楚的还是混乱的？ 09/30 21:14
12F：→ Ice9: 另外，不知道质体的情况就敢硬干 下去，你们很有勇气吔 09/30 21:15
13F：→ ad1980: 把原本的 plasmid A 拿去定序，看看 plasmid sequence 是 10/24 22:45
14F：→ ad1980: 什麽，cutting site 有没有对，insert A 是不是对的，都 10/24 22:45
15F：→ ad1980: 对了以後再继续。 10/24 22:45
16F：推 ad1980: 可以在 insert 里面设计两个 primers 往外面定序，确认 Xb 10/24 22:48
17F：→ ad1980: aI/XhoI site，顺便确认 vector sequence。 10/24 22:48
18F：推 mollyapple: 定序primer再重新设计夹A多一点试试看 12/10 14:02