作者kyuxi0203 (tiffany)
看板Biotech
标题[求救] western同一片膜但背景有些脏有些乾净
时间Wed Aug 18 20:47:27 2021
各位前辈好，最近在做western上遇到了一些问题，想请各位帮帮忙
步骤如下：
running:上胶80 V, 50 min，下胶：130 V, 120 min
transffering:400 mA, 2 hr
blocking: 5%脱脂奶粉, 1 hr
wash三次十分钟後裁膜加一抗overnight，
隔天回收一抗，wash三次十分钟加二抗室温一小时，
再wash三次十分钟，UVP拍照
这时就出现了同一张膜有的抗体背景乾净，有的却很脏，
不知道前辈们是否能帮忙troubleshooting，谢谢！
https://imgur.com/8h3kZt6
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1F：→ blence: 下次两片membrane用同一支抗体再来比较背景08/18 20:56
2F：推 tynse71864: 同上，但八成只是上面那只抗体就是脏...08/19 03:18
3F：推 r03b43022: 1.同张膜的话，哪一个是stripping 後的（stripping不乾08/19 07:33
4F：→ r03b43022: 净）？还是位置不同（裁切）2.标的、抗体稀释倍率？（08/19 07:33
5F：→ r03b43022: 可能目标弱，成色时间拉长背景跟着上升）3.增加wash 次08/19 07:33
6F：→ r03b43022: 数，每次wash时间缩短4.确保二抗新配5.有的一抗会因为08/19 07:33
7F：→ r03b43022: 压的次数增多而变乾净（非专ㄧ讯号随压的次数增加而减08/19 07:33
8F：→ r03b43022: 少）08/19 07:33
1. 位置不同
2. arg-1 1:1000
因为讯号比较弱所以把二抗从1:10000调整到1:5000
※ 编辑: kyuxi0203 (101.9.172.69 台湾), 08/19/2021 08:44:05
※ 编辑: kyuxi0203 (101.9.172.69 台湾), 08/19/2021 08:45:48
9F：→ blence: 一抗浓度,时间可以改,蛋白量可以调整,曝光时间也可以拉长08/19 13:19
10F：→ blence: 甚至ECL还可以换更灵敏的,唯独二抗条件最没更动需求08/19 13:20
11F：推 waveking: 觉得比较可能是blocking buffer 有沉淀出问题，建议配完08/19 15:19
12F：→ waveking: 奶粉的时候过个PES 0.22膜08/19 15:20
13F：推 r03b43022: 也可以改用3% BSA blocking试试，盒子也要注意乾净08/19 16:27
14F：→ blence: 用0.22 filter去过milk是认真的吗？08/19 17:57
15F：→ xxtomnyxx: 他大概不知道牛奶的组成吧www08/19 21:56
16F：→ xxtomnyxx: 离心就好，顺带一提，关於这个部分，其实我最近手上有08/19 21:56
17F：→ xxtomnyxx: 些有趣的结果ww08/19 21:57
18F：→ williamyang: 单纯是上面抗体很脏,有品牌货号或许有机会帮你解决08/20 02:54
感谢各位的帮忙~ 配了新的之後好很多了!
※ 编辑: kyuxi0203 (101.9.49.253 台湾), 08/20/2021 18:04:28