作者isorange (桔)
看板Biotech
标题[求救] PBMCs上flow但抗体染不上去
时间Sun Nov 8 21:33:38 2020
各位大大好，我的实验目前是从小鼠中分离出PBMCs然後染monocyte 上flow看细胞群比例
但是卡在无奈我怎麽染都染不出来！！
问过学长姊以及别家实验室的人、抗体重买新的、步骤条件也不敢乱改
但怎麽样就是失败
染色抗体为：
BioLegend的PEcy7 anti-mouse CD11b 和Biotin anti-mouse Ly6c
皆在4度西反应30分钟
Load抗体的时确认每个tip都有插入细胞液里面
这是学姊的图
https://i.imgur.com/7QyrY2o.jpg
这是我的图
https://i.imgur.com/KwPEbdF.jpg
很明显cd11b根本都没染到！！但就是无解
请各位大大提供一些建议救救我TT
--
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1F：推 RaventheCrow: 感觉比较像population分不开，不是完全没染到 11/09 02:15
2F：推 RaventheCrow: 有一部分的确有染到，所以偏右的地方APC-Cy7 hi和in11/09 02:19
3F：→ RaventheCrow: t的两群有出现，但就算你整框移过去比例也不会高到11/09 02:19
4F：→ RaventheCrow: 像你学姐一样，因为有一部分是没吃到染剂/和原本pop11/09 02:19
5F：→ RaventheCrow: ulation没分开，所以像被low expression的那群吃掉11/09 02:19
6F：→ RaventheCrow: 一部分成员11/09 02:19
7F：→ RaventheCrow: 应该也不是单纯电压和compensation 问题，因为分不11/09 02:22
8F：→ RaventheCrow: 开可以想像成是两颗球重叠在一起，就算把外框拖移11/09 02:22
9F：→ RaventheCrow: 变形，重叠的部分也不会分开11/09 02:22
10F：→ RaventheCrow: 分不开时我成功过的方法只有重染、或改染色条件（11/09 02:28
11F：→ RaventheCrow: 像染色时的温度）、换不同色的染剂（弱表现的抗原配11/09 02:28
12F：→ RaventheCrow: 强染剂），染色时间30分钟应该够长我觉的不用变（11/09 02:28
13F：→ RaventheCrow: 更长没洗掉，在某些sample会high和int expression11/09 02:28
14F：→ RaventheCrow: 挤在一起，但Case by case)11/09 02:28
15F：→ RaventheCrow: 看有没有其他更有经验的大大愿意分享(?)，因为我自11/09 02:29
16F：→ RaventheCrow: 己有时遇到也满头痛的11/09 02:29
谢谢大大提供的方向！
17F：推 MartianIT: 叫你学姐和你side-by-side染一次 她一个口令你一个动作11/09 08:10
18F：→ turtle24: 两个人相同材料各做一次，先排除人的问题11/09 11:39
就是学姊们已经毕业了只能隔空抓药QQ
※ 编辑: isorange (49.216.22.31 台湾), 11/09/2020 12:06:39
19F：→ a90648: 避光有确实吗？之前sorting时发生过随着时间PE讯号越来越 11/09 17:29
20F：→ a90648: 强，後来推断是PE-Cy7断了恢复成PE,不过那只发生在旧抗体 11/09 17:29
21F：→ a90648: ，换新抗体後就没再发生过了 11/09 17:29
22F：→ Sylvaine: 你用接了biotin的抗体染Ly6c，有记得染二抗吗？ 11/09 19:25
23F：→ Sylvaine: 抱歉，回太快，没看清楚是CD11b没染到 11/09 19:26
24F：推 tynse71864: 有没有可能抗体旧了染的效果不好了？ 11/09 20:55
有避光且都放在冰上，已经是新买的了呜呜
25F：推 tynse71864: 我蠢了没看到....染不均匀的可能性？ 11/09 21:07
谢谢大大，我下次往这个方向修正看看
26F：→ biolegend: CD11b 跟Ly6c 是分开染还是一起染？ 11/09 21:13
27F：→ biolegend: 另外抗体clone物种来源是否都是rat ? 11/09 21:16
是一起染的喔！来源也都是一样的
※ 编辑: isorange (101.14.194.128 台湾), 11/10/2020 01:54:13
28F：→ williamyang: 染个BD compBeads就可以知道抗体有没有讯号了 11/10 08:47
29F：→ biolegend: 请分开染 clone物种来源一样很常会有染不到情形 除非 11/10 12:12
30F：→ biolegend: 是不同物种 比如rat & rabbit 才可以costain 你的学姐 11/10 12:12
31F：→ biolegend: 当初应该是挑了不同物种的clone才costain成功 11/10 12:12
32F：→ tynse71864: 等等楼上是 biolegend (跪 11/11 18:45
33F：→ greenwind: 1.PECy7 channel确定可以detect到吗? 2.换个颜色吧! 12/04 14:48
34F：→ misssquid: 你的Buffer有加界面活性剂打洞细胞壁吗？ 03/05 20:08
35F：→ misssquid: 细胞膜啦(蠢) 03/08 13:33