作者janewu945 (I am who I am)
看板Biotech
标题[求救] T4 DNA ligation
时间Thu Sep 10 02:11:25 2020
前提
Vector : pET28b （里面包含其他东西，总共6019bp），想切除NdeI&BamHI(30bp)，再将
insert接入
Insert : 为老鼠基因在pCMV3上（900bp)
(restriction cut : NdeI&BamHI )
小妹我最近在做T4 ligase状况很多
........................................................
Vector 在单切NdeI 时会多一条band
https://i.imgur.com/5quBTRl.jpg
做完ligations 时，一样有那条band却导致位置完全不一样
预计切完时vector为6000bp , insert 为1000bp
却在3000时有两个band....= =
Insert却只有750bp
（图为RE CUT 做确认是否有无接上）
https://i.imgur.com/eG3BTM5.jpg
想问看看大家有没有这样多问题
NdeI那边是ghost band吗？
我已经不知道该怎麽办了......= =
Insert有换了新的primer做还是一样
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 49.216.167.79 (台湾)
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※ 编辑: janewu945 (49.216.167.79 台湾), 09/10/2020 02:13:10
1F：推 ldy: 送定序看看09/10 02:58
2F：→ roy047: 同意vector可能不是你的plasmid...@@ 或者挑single重抽09/10 05:00
挑20颗菌的状况都一模一样，会有这种状况吗......囧
※ 编辑: janewu945 (49.216.167.79 台湾), 09/10/2020 09:00:34
3F：推 blence: pET28b里面包含其他东西,切RE还是多检查一下09/10 13:38
4F：→ blence: 前面提到insert是切下来的,後面却说换primer做还是一样?09/10 13:39
5F：→ blence: 还有这是哪一家的RE,是一般的吗？09/10 13:40
Vector里面已接进去的insert没有NdeI的切位
restriction enzyme都是跟NEB，是这一月买的。
vector实验顺序
A. re cut
1.NdeI(incubate at 37C for 1hr & heat inactive at 37C for 20min)
2.BamHI (incubate at 37C for 1 hr)
B. Gel extraction
再去测浓度完做T4 ligations
※ 编辑: janewu945 (49.216.167.79 台湾), 09/10/2020 14:11:38
6F：→ blence: 看样子1.的NdeI切完没有额外换buffer,就直接加BamHI去切? 09/10 22:52
7F：→ xxtomnyxx: 从胶图来看，要不是这个plasmid的纯化做的非常非常差 09/11 11:07
8F：→ xxtomnyxx: ，要不是这根本不是pET28，没标marker大小不好判断。 09/11 11:07
9F：→ xxtomnyxx: 然後以我的经验，在6000 bp的大小仅仅30 bp的差别跑胶 09/11 11:07
10F：→ xxtomnyxx: 非常非常难分，可是你的band却有明显shift，我会怀疑 09/11 11:07
11F：→ xxtomnyxx: 你的vector其实是错的。 09/11 11:07
12F：推 dargen78: NEB的NdeI与BamHI可以用cutsmart buffer同时切吧？应该 09/11 18:52
13F：→ dargen78: 不需要分两次 09/11 18:52
14F：→ dargen78: 然後同意只切30bp下来不应该有如此大的shift 09/11 18:52