作者jasontang (Yankee Hotel Foxtrot)
看板Biotech
标题Re: 质体
时间Tue Aug 25 06:14:04 2020
1F：→ xxtomnyxx: PCR 用 high-fidelity DNA polymerase 便宜又几乎不出 08/21 16:11
2F：→ xxtomnyxx: 错，不像以前标榜 HF 还是错一堆。 08/21 16:12
3F：→ xxtomnyxx: 可是在传统 RE 法长大的教授和一些学生还是会觉得 PCR 08/21 16:13
4F：→ xxtomnyxx: 做的东西不定序不安心，而且 RE 还是比新一代的方法便 08/21 16:13
5F：→ xxtomnyxx: 宜很多(虽然要看用什麽RE)，单纯的把 insert 从A质体换 08/21 16:14
6F：→ xxtomnyxx: 到B质体也是RE比较安定。 08/21 16:15
我本身在美国的合成生物学中心念博班 也有去英国的实验室交换过
基本上这些实验室每天就是不停地做cloning
以原po的问题来说通常会用Gibson Assembly
但是只要有用到PCR的部分 不管用的酵素多好都一定还是会定序
也因为如此Gibson Assembly往往只用在小规模的cloning
日常来说最主流的就是Golden Gate cloning (Type IIs RE + DNA ligase)
还有Gloden Gate衍生出的MoClo (modular cloning)
通常把insert做成part plasmid的时候会做定序
之後的组装过程就不用再定序了 因为没有用到PCR
这样对要拼大一点的质体来说比较有效率 通常20kb以内都没甚麽问题
顶多送Addgene保存之前会定序一次
有些实验室会用Gateway cloning 原因也差不多
另外推荐一下Addgene的Plasmids 101 (有PDF版本)
https://blog.addgene.org/plasmids-101-what-is-a-plasmid
可以对常用的cloning方法有初步的认识
通常新加入实验室的成员我们都会请他们先浏览一遍
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 18.20.15.46 (美国)
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1598307249.A.D0D.html
7F：→ xxtomnyxx: MIT吗？我在阳明几乎没有其他实验室一直有需要做clonin 08/25 07:41
8F：→ xxtomnyxx: g了。我其实没做过gibson，倒是常用Type IIs，只是现在 08/25 07:41
9F：→ xxtomnyxx: Type IIs可以用的酵素还太少而且都偏贵，如果需要clone 08/25 07:42
10F：→ xxtomnyxx: 的序列是 genome 上的或是 ORF，很常遇到撞酵素而难以 08/25 07:43
11F：→ xxtomnyxx: 下手..... 08/25 07:43
12F：→ xxtomnyxx: 而且 Type IIs 设计成模组化之後，万一需要在两个设计 08/25 07:44
13F：→ xxtomnyxx: 好的模组中间再插进一个模组会很麻烦，NEB建议Type IIs 08/25 07:44
14F：→ xxtomnyxx: 一次连接的片段不要超过6个，虽然我最多一次接8个还很 08/25 07:45
15F：→ xxtomnyxx: 成功，但是这样一来能安排的模组数量就会很有限。 08/25 07:46
16F：→ jasontang: 没错！所以我们insert通常都是合成的 把切位移除同时 08/25 09:49
17F：→ jasontang: 顺便做codon optimization 08/25 09:49
18F：→ jasontang: 要在中间加新模组的确是麻烦 要额外加工 08/25 09:52
19F：→ jasontang: 模组数量的话我们是用MoClo一层一层叠上去 理论上两三 08/25 09:54
20F：→ jasontang: 个酵素就够无限叠加了 08/25 09:54