版上大大好，最近做实验撞墙想请大家帮忙troubleshooting orz 我要帮一个正向单股RNA病毒定全长genome，所以在做RACE 这个病毒没有poly(A) tail，参考文献後决定抽完RNA後加上poly(A)再用oligo dT转cDNA 病毒来源是细胞加上清液一同冷冻解冻後的混合液 抽RNA的kit是QIAamp viral RNA kit，最後用AVE回溶 polyadenylation 是用 thermo 的Poly(A) tailing kit (AM1350) 因为我只是要做3'RACE (Roche)，RNA不用太多，所以我把reaction volume降至25 ul PCR的部分是用taq系列 以gene-specific forward搭配dT後接的anchor primer来p 第一次操作很顺利，3'RACE有成功做出来，但之後操作不同毒株就一直失败... 我做了一些测试，感觉是cDNA没转出来 因为拿接近3'end的reverse primer搭配成功的forward primer没办法p出产物（确认可用） 我有几个点想请教大家的意见 第一是我发现加完A tail的reaction mix里会有白色的沈淀，有人知道这是什麽吗＠＠ 第二是因为RNA有细胞跟病毒的部分，run gel看是否有加上A tail似乎不实际？ 不知是否有其他方式能帮助评估 A tailing是否成功 第三是关於kit内有ATP solution，protocol有注明其对温度很敏感 我基本上都在冰上操作，只有解冻的时候会因为弹tube或spin down离开冰上 但我有可能是我第一次操作完ATP solution就失效吗＠＠ 第一次碰这个kit 成功来得突然，失败出现得太快orz 以上问题，还希望版上大大帮忙解惑，谢谢！！！ --

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