各位前辈好 最近做co-ip跑银染时band都不是很理想 想麻烦前辈们帮忙看看是不是哪里出问题> < 感激不尽！！ 简述co-ip做法： 先用protein A的beads binding antibody 再加入protein lysate mix overnight 隔天再用sample buffer 煮100度10分钟elution 跑胶load sample时会连磁珠一起下去跑 曾经有使用过total protein lysate去做coip并染coomassie blue（步骤与前述都相同） 有band但感觉杂band超级多 https://i.imgur.com/lRODvjd.jpg 後来改抽membrane protein去做coip 用的是Thermo的MEM-PER plus kit 下800mg的protein去做binding 第一次做没有测elute出来的蛋白浓度 下20ul含beads去染银染 银染用Thermo的silver stain for mass spec kit做 band的深浅看起来超不稳定 右方两组是IgG 其他都是实验组 https://i.imgur.com/8WPv78E.jpg 第二次做有测浓度 最後elute出来的蛋白浓度约0.3mg/ul 下40ul含beads去染银染 右方两组是input 中间两组是IgG 左方两组是我的实验组 https://i.imgur.com/GhR5puJ.jpg 第二次下的量明明比较多 但看到的band却比较少 看最上方好像是都卡住没有跑下来 ( ? 猜测可能的问题有 1.胶体配错 2.磁珠太多 3.elution用的sample buffer elute不下来 但先前染coomassie blue步骤一样好像也没这个问题 麻烦各位救救我了 谢谢！！！！！！！！ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 140.112.122.220 (台湾) ※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1579098346.A.6DF.html ※ 编辑: evayoyo (140.112.122.220 台湾), 01/15/2020 22:27:26 ※ 编辑: evayoyo (140.112.122.220 台湾), 01/15/2020 22:28:05 ※ 编辑: evayoyo (140.112.122.220 台湾), 01/15/2020 22:29:46 ※ 编辑: evayoyo (140.112.122.220 台湾), 01/15/2020 22:31:54 想请教跑出来的band这麽奇怪会是因为上方卡了很多像蛋白的东西没有完整跑下来吗？有的 我有wash，但是是用PBS wash，当初是另一个实验室的学姐建议的，她有这样做过说没有问 题。请问要怎麽确定饱和呢？抱歉我是新手问题很多QQ 我coip抓下来的东西有去压western 也有看到我目标蛋白的band，但在银染的图中该位置却没有看到band，谢谢你的建议！但是 现在银染都没有band QQ ※ 编辑: evayoyo (101.15.140.197 台湾), 01/16/2020 02:34:41