作者hachibuya (黄金骑士 牙狼)
看板Biotech
标题[求救] ChIP 转录因子negative和positive primer
时间Tue Nov 19 11:21:28 2019
我现在要做ChIP-qPCR确认治疗前後转录因子bind的目标promoter是否有增加
抗体(SP1和STAT3)都准备好了是CST ChIP等级的抗体
阴性对照的IgG抗体和磁珠beads也准备好了
预测promoter也从目标gene的上游2000 base估了3到4组primer
书上说最好要有转录因子negative control locus和positive control locus的primer
查了一下可以从文献上面找(但查了半天查不到 人类乳癌细胞MDA231 SP1和STAT3)
有出ChIP Kit的也会附primer 但没有要买的打算 商品也查不到序列
另外有人是从ENCODE从别人做过的ChIP-seq 找高表现和无表现的序列当positive或negative
但是ENCODE的介面实在看不太懂 细胞种类也不完全吻合
不知道有没有人能教我怎麽设计SP1和STAT3用的negative和positive primer
还是说已经用了ChIP等级的抗体就不需要这些primer了?
已经卡了好几天了
希望能得到帮忙 感激不尽
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 133.87.71.225 (日本)
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※ 编辑: hachibuya (133.87.71.225 日本), 11/19/2019 11:22:58
1F：→ blence: 你想kit附的primer会是以细胞种类吻合与否当前提吗 11/19 12:32
2F：→ xxtomnyxx: [s]直接做ChIP-seq吧！[/s] 11/19 18:05
3F：→ xxtomnyxx: 不过你ENCODE介面看不懂，ChIP-seq可能也看不懂怎麽分 11/19 18:06
4F：→ xxtomnyxx: 析？就算看得懂ENCODE并找到几个乳癌细胞株都有SP1、 11/19 18:07
5F：→ xxtomnyxx: STAT3 binding的位置，你还是需要设计3~5对不同peak位 11/19 18:08
6F：→ xxtomnyxx: 置的primer做positive control，以免ChIP有成功却因为 11/19 18:09
7F：→ xxtomnyxx: 选定的positive位置出问题没讯号而误以为ChIP失败 11/19 18:09
8F：→ hachibuya: 感谢回覆 现在努力研究ENCODE中 谢谢 11/19 21:46
9F：→ xxtomnyxx: 你不一定要找ENCODE上有资料的基因当positive，STAT3很 11/20 01:00
10F：→ xxtomnyxx: 多研究已经有找出它的下游基因了，从这些下游基因里挑 11/20 01:01
11F：→ xxtomnyxx: 几个设计primer，做一组ChIP w/wo STAT3 antibody，只 11/20 01:02
12F：→ xxtomnyxx: 要设计的primer在STAT3 ChIP的样本有讯号而NC ChIP中没 11/20 01:03
13F：→ xxtomnyxx: 讯号或讯号超级弱，就能拿它当 positive。SP1更是一个 11/20 01:04
14F：→ xxtomnyxx: 到处都会binding的TF，要找到它的target gene很容易， 11/20 01:05
15F：→ xxtomnyxx: negative的primer我就比较不清楚了，不确定是要找targe 11/20 01:05
16F：→ xxtomnyxx: site隔个5~10 kbp的位置还是要找已知不会被这些TFs 11/20 01:06
17F：→ xxtomnyxx: binding但是在你的细胞株中有表现的基因？ 11/20 01:07
19F：→ xxtomnyxx: 上面的连结，点Documents，里面有一些NC primer可以设 11/20 01:17
20F：→ xxtomnyxx: 计的参考位置，它没有给primer sequence(毕竟要卖)，但 11/20 01:18
21F：→ xxtomnyxx: 能从那个区域去设计你的NC primer，我找了下，其实这些 11/20 01:18
22F：→ xxtomnyxx: 资讯很容易找，你应该是要培养找到这些资料的能力的。 11/20 01:21
23F：→ xxtomnyxx: 顺便告诉你一件事吧，TFs不一定binding的位置是在 11/20 01:23
24F：→ xxtomnyxx: promoter，除非你本来就知道或已经有人证明过会binding 11/20 01:24
25F：→ xxtomnyxx: 在那里，否则直接用promoter上游几kb当做target是有可 11/20 01:24
26F：→ xxtomnyxx: 能做不出来的，甚至binding其实是在超级远的enhancer上 11/20 01:25
27F：→ xxtomnyxx: ，这种情况除非你ChIP做得非常好，不然从promoter设计 11/20 01:26
28F：→ xxtomnyxx: primer都是有风险的，虽然有些人认为这风险可以忽略... 11/20 01:26
29F：→ hachibuya: xxtomnyxx感谢您愿意分享那麽多知识给我,後来我和老师 11/20 09:30
30F：→ hachibuya: 讨论,虽然他也没有做过ChIP,不过他认为有用IgG做阴性 11/20 09:31
31F：→ hachibuya: 抗体的话应该就可以当作negative control,不过从您给的 11/20 09:32
32F：→ hachibuya: 连结,我会试着从上面写的Gene desert上设计看看,另外 11/20 09:32
33F：→ hachibuya: 关於binding site,我现在试着从ENCODE上别人做过的ChIP 11/20 09:33
34F：→ hachibuya: seq上找看看,我想看的基因确实在上游附近有满高倍的表 11/20 09:34
35F：→ hachibuya: 我会从这些区域100bp前後设计primer,再加上电脑模拟的 11/20 09:35
36F：→ hachibuya: 几个binding site去设计primer,看做不做得出来 谢谢您 11/20 09:36