作者evayoyo
看板Biotech
标题western blot internal control
时间Wed Jul 10 23:53:25 2019
各位前辈好
近期在跑western时经常会出现压GAPDH糊掉的情况，但一直找不到原因是什麽QQ
做胶的部分(10%)：
下胶
H2O 4ml
30% Acrylamide/Bis 3.3ml
1.5M Tris (pH 8.8) 2.5ml
10% SDS 100ul
10% ammonium persulfate 100ul
TEMED 4ul
上胶
H2O 1.68ml
30% Acrylamide/Bis 0.51ml
1.5M Tris (pH 6.8) 0.75ml
10% SDS 30ul
10% ammonium persulfate 30ul
TEMED 3ul
30% Acrylamide/Bis和TEMED
-commercial拿来直接用
1.5M Tris (pH 8.8/pH 6.8)
-commercial 10X稀释buffer再调pH值
10% SDS和10% ammonium persulfate
-粉末稀释自己配
能自己配的试剂都有重新配过
还是一样糊
跑胶的条件70V 20mins 110V 70mins
transfer的条件350mA 1hr
transfer完的marker都很完整很美
抗体的部分一抗二抗也都用其他支试过了
结果都一样
真的很困扰QQ
有去其他实验室用他们的器材&试剂
借跑过western
跑出来的band很是漂亮
所以应该不是手残的问题
麻烦各位高手指点了
谢谢！！！
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 180.204.244.30 (台湾)
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1562774007.A.968.html
1F：→ Ianthegood: 有染ponceau看看吗 marker那行转过去了不代表整张都07/11 01:02
2F：→ Ianthegood: 转得很美
目前还没有试过耶 除了GAPDH以外我要看的protein都压的OK就没想到要试
如果无法解决可能会试试看 谢谢~
3F：推 tynse71864: 图片支援一下07/11 02:26
4F：推 uouim: Running buffer 稀释後不需调pH
没有喔调pH值的是Tris
Running buffer跟transfer buffer稀释完直接用我上面漏打了
5F：→ turtle24: 附个图比较好，有时候是压片手抖的关系07/11 08:17
※ 编辑: evayoyo (49.216.220.198 台湾), 07/11/2019 11:57:12
8F：→ evayoyo: 大概是这种band会往旁边扩散的情况07/11 12:00
※ 编辑: evayoyo (49.216.220.198 台湾), 07/11/2019 12:02:09
10F：→ Ianthegood: 看起来不像糊掉 你的lane的数量是对的 看起来是往下跑07/11 16:03
11F：→ Ianthegood: 的时候会扩张 染ponceau大概会看到lane变成锥形 如果 07/11 16:03
12F：→ Ianthegood: 别的实验室完全同样sample没事的话可能是胶的侧边有漏 07/11 16:03
13F：→ Ianthegood: 之类的
好的，那我用别家实验室的做胶仪器试试看会不会一样，谢谢~
14F：推 huosheng: 的确可以用ps染membrane，transfer後的gel也可以用cooma07/11 16:32
15F：→ huosheng: ssie染，先厘清问题点在哪里
了解，之後会再试试看，谢谢~
※ 编辑: evayoyo (101.14.245.31 台湾), 07/11/2019 23:31:23
16F：推 Devilxxx: 跑胶的时候有冰浴吗？温度升起来也有机会糊掉加上GAPDH 08/24 01:59
17F：→ Devilxxx: 很下面 08/24 01:59