作者steve42125 (Shiburin)
看板Biotech
标题[求救] Spheroid single cell离不下来
时间Sat May 18 17:20:47 2019
各位好
最近想要将培养好的Spheroid cell打散成Single cell後
用Flow cytometry做分析
打散的部分是用Accutase常温处理，在显微镜下观察打散的效果还不错
但是离心1250rpm, 5min之後发现Pellet有明显缩小的情形
这边还不打紧
硬是取了需要的细胞数到Eppendorf後准备离心进行Fix
这边原本是用300g, 5min
但发现奇怪的是有的细胞离得下来变成pellet，
有的细胞的pellet会在管壁上排列形成一条线，
有的离完甚至看不到Pellet，
事实上在打散Spheroid cell之後可以看到细胞明显变小，
有试过把离心速度和时间都慢慢往上调
甚至调到了3500g, 10min (对你没看错) 还是没办法让细胞在底部形成pellet
有试过将15ml离心管跟Eppendorf都先用2.5%BSA/PBS coating
但是好像没有太好的效果......
想请问有做过这方面实验或是对Flow的操作流程有经验的各位
可以提出我可能需要更改的条件
不然每次养了两三个礼拜的Spheroid都被Eppendorf吃光根本QQ
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1F：推 tynse71864: acctuase建议是不用neutralize, 但不知中和反应能否改 05/18 20:49
2F：→ tynse71864: 善现象? 因为听描述，细胞感觉快挂掉了… 05/18 20:49
确实是，应该说Accutase终止反应只需要用5倍体积的PBS稀释就可以
所以加入PBS之後还是需要离心重悬计数，
取细胞到Eppendorf後再离心才开始固定跟染色
(我是要染Intracellular所以要先固定+打洞)，就是在最後这边离心一直离不下来....
因为之前都是染一般贴附型的细胞都可以用正常的量去染(1*10^6)就没遇过这种问题
Spheroid single cell的细胞数很少所以最多都只能用2.5*10^5，才遇到这个情况....
※ 编辑: steve42125 (36.224.21.211), 05/18/2019 21:18:12
3F：推 tynse71864: 之前 T cell 用10^5 离还是有 pellet，但就是一颗点XD 05/19 21:26
4F：→ tynse71864: D 有时候也像你说的管壁一条线，记得是加 PBS 时把壁 05/19 21:26
5F：→ tynse71864: 上的冲下来+轻轻 pipet，再重新新离心会比较容易离下 05/19 21:26
6F：→ tynse71864: 来 05/19 21:26
7F：推 tynse71864: 另外如果是 fix 前一步下不来，有没有考虑直接加等体 05/19 21:32
8F：→ tynse71864: 积2x 浓度的 PFA fix , 结束後离心? 之前flow这样做 05/19 21:32
9F：→ tynse71864: 过没问题 05/19 21:32
10F：推 tynse71864: 虽然很像治标不治本 XDD 05/19 21:35