作者forever430 (Right of Left)
看板Biotech
标题[求救] 如何提升RNA提取质量
时间Mon Apr 22 21:55:13 2019
大家好，目前提取RNA遇到一个瓶颈，想请版友指点迷津：
收集RNA的步骤是使用Trizol and Chloroform 去提取，我的样品条件会同时重复8组，每
一组样品下25万颗细胞，之前都能顺利收到足够质量的RNA进行後续转cDNA步骤，但最近
出现相同手法但是总质量都过低情况。
每次收集下来的RNA我都固定溶於10ul DEPC water，所有样品固定使用1ml Trizol进行提
取。
第一次失败样品总共重复8组，我想说过程可能不小心出错，第二次保险起见，我样品准
备了10组（提高细胞数量），并以相同提取方法再试一次，分析浓度後如下图：
https://i.imgur.com/RGlqkx2.jpg
第三次我一样准备10组样品，此次改变一些手法，样品使用冰的PBS进行清洗後（看能否
避免降解）再加入Trizol，加入Trizol後再使用刮棒进行刮除，接着把Trizol吸取到15ml
离心管，放置到冰浴上(希望能避免降解），接着再清洗第二组样品，然後把离心管内的T
rizol再抽出来加入第二组样品，重复步骤持续下去...
分析的浓度如下图：
https://i.imgur.com/ki1w6uC.jpg
由於RNA转成cDNA需要5ug，已连续3次出现整体RNA质量不足的情况，目前想不出哪些可能
原因造成此情况，想请版友不吝指教或者分享相关经验。
谢谢 感激不尽
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 58.114.139.73
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1555941315.A.9F6.html
1F：→ jjlee: 纯度很高，传统法的产率不太受降解影响。 提高细胞量增加 04/22 22:32
2F：→ jjlee: 到10Λ6应该就ok了04/22 22:32
但是之前的组别只需要8组样品就能收到，此次数量多2组又质量不足，实在想不透
※ 编辑: forever430 (58.114.139.73), 04/22/2019 22:58:26
3F：推 qiet: Trizol效期? 环境Rnase清洁?
04/22 23:54
谢谢Q大，效期的部分明日会确认看看，东西移出操作台後，使用的器具跟桌面都有使用7
5% E
tOH/DEPC擦拭
4F：→ jjlee: 细胞定量法是否真的准确？ 细胞类型跟之前是否一样？ 产04/22 23:56
5F：→ jjlee: 量降到之前的多少%？ 试剂(包含DEPC水)是否都是相同的sto04/22 23:56
6F：→ jjlee: ck? 定量用的cuvette是否相同？ 是否能找到Nanodrop测定？04/22 23:56
谢谢J大，关於细胞数量部分，样品处理前会使用光学显微镜观察，细胞密度看起来跟以
前没太大差异，先前8组样品一起收下来的RNA约600-750ng/ul，总体积一样回溶在10ul，
回溶後我都固定存放於-80冷冻2天再进行分析浓度，分析完後直接转cDNA。
DEPC water、 Chloroform 、isopropanol都是室温保存，但之前存放Trizol的冰箱故障
，不知道是否有影响？
分析浓度是以nanodrop，取出样品1ul进行分析，分析前先以DEPC water当blank，所以之
前的浓度在分析完後剩下9ul，是足够5ug进行後续cDNA步骤
分析的仪器如图片，厂牌Microdigital
https://i.imgur.com/FnZ9iBh.jpg
※ 编辑: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:11:41
※ 编辑: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:12:32
※ 编辑: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 00:20:09
7F：→ jjlee: 之前Trizol加入後是否还需要刮？ 一般细胞Trizol加入後就04/23 00:39
8F：→ jjlee: 溶掉了04/23 00:39
之前没有刮耶，都是pipette冲一冲就好
※ 编辑: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 01:07:15
9F：推 tynse71864: 我想问一下 ，转 cdNa 需要 5ug 是实验要求还是按照步04/23 09:03
10F：→ tynse71864: 骤？ 04/23 09:03
11F：推 tynse71864: 我之前100ng 都转完上 RT 成
功惹 04/23 09:05
T大，我是按照实验步骤，细胞实验是到合作实验室进行，转cDNA的步骤是依照对方给的
。我好像看到一线希望@@
※ 编辑: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 10:16:52
目前没步骤，印象是oligo dt 1ul 、10mM dNTP 1ul、总共5ug RNA、剩下不足体积
以DEPC water补满，总体检13ul。
※ 编辑: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 10:21:16
12F：→ jjlee: 之前没有刮耶，都是pipette冲一冲就好 →→ lysis有问题，04/23 10:42
13F：→ jjlee: 细胞未完全溶解，RNA抽不出来04/23 10:42
J大，之前的方式是反覆吸取冲一冲，是可收到足够量，直到出现第一次浓度过低後，我
第二次再重复一次也是如此，第三次使用刮棒重复刮个3-4次，刮棒都有去沾trizol再去
刮样品表面
※ 编辑: forever430 (58.114.139.73), 04/23/2019 11:09:07
14F：推 as862437: 转cDNA的kit是？5ug 的总量满高的了，目前实验室SSIII04/23 18:17
15F：→ as862437: 都只用 1ug 转04/23 18:17
首先第一步是加入下列试剂
1ul Oligo dT
1ul 10mM dNTP
DEPC water(最後看差多少体积补足到13ul)
5ug的RNA
总体积:13ul
最後加入的试剂如下:
5x first strand reaction buffer: 4μl
0.1M DTT: 1μl
RNase out: 1μl
Super Script III (SS III): 1μl
总体积为20ul
再放进机器去跑
※ 编辑: forever430 (140.116.159.183), 04/23/2019 18:51:50
16F：推 sarusama: 你们RNA量加太多了,RNA超过1ug会出问题,导致最後RT出来 04/23 21:25
17F：→ sarusama: 的cDNA量参差不齐,1ug?1.5ug?2ug? sample的cDNA浓度不同 04/23 21:25
18F：→ sarusama: cDNA是用来做其他实验就算了,如果是用来做qPCR会有误差04/23 21:26
19F：推 tynse71864: 建议上网直接找 ssiii的步骤啦～ 口耳相传的步骤很容04/23 22:07
20F：→ tynse71864: 易出问题 XDDD04/23 22:07
忘了说明後续是做reverse PCR,感谢大家的意见
※ 编辑: forever430 (223.138.55.87), 04/24/2019 00:50:53
21F：推 ChloeClark: RNA dry太乾了？ 04/25 22:13
22F：推 huuban: SSIII下5 ug不会太多啊, 而且问题根本不在这里吧XD 04/26 00:28
23F：→ huuban: 看起来不太像降解, 因为RNA碎片也是有浓度的喔XDD 04/26 00:29
24F：→ huuban: 比较可能是操作上失手了, 例如C大说的dry的时候 04/26 00:29
25F：→ huuban: 之前碰过容易残留DNA的样本~技术越熟练抽完浓度还越低.. 04/26 00:32
26F：→ huuban: 发现是因为残留的DNA越来越少的缘故 04/26 00:34
27F：推 ChloeClark: 如果同样的步骤跟样本，之前做很好，现在做不休，除了 04/26 07:22
28F：→ ChloeClark: 是否dry太乾之外（rna乾掉不溶於水），最好重新确定一 04/26 07:22
29F：→ ChloeClark: 次自己的试剂浓度没有问题，之前碰过有人wash rna用 04/26 07:22
30F：→ ChloeClark: 的酒精浓度跑掉，洗之前看得到pellet，洗完pellet不 04/26 07:22
31F：→ ChloeClark: 见，定量的浓度永远都很低。 04/26 07:22
32F：推 greenwind: 建议买抽RNA的kit,自此之後细胞量可不用多,quality提 04/29 00:12
33F：→ greenwind: 高且稳定 (旭基的,记得每一sample不贵) 04/29 00:12