※ 引述《IFN113 (CY)》之铭言： : (手机排版) : 呜呜呜呜呜呜呜呜 : 先感谢点进来的大大们 : 小妹压力爆棚快往生了 : 老板一直觉得为啥核比较大颗 (??) : 为什麽没办法染出mitochondira 均匀分布在细胞的样子，老板说要看到均匀分布的美图呀QQ : 本lab目前没有存在做过的人，小妹我也是自己摸索试看看，无人能讨论故求板上大神们解救一下呜呜 : 以下为小妹做的方式 : 免疫萤光染色 : 1. 种细胞 : 取2.5 ×105 cell/well transfected 好的HEK293T cell 种於24mm圆玻片上培养16小时，去除上清液，wash PBS 2次，加入混有200nM Mitotracker的medium 培养40分钟 如同推文所说,其实HEK293 or HEK293T的贴附力普通偏烂,将Polylysine稀释至0.01%後过滤,之後滴在玻片上室温反应15分钟吸掉,再用PBS快速洗过两次就可以种细胞 你的结果里看到的DAPI形状是正常的,表示细胞并没有因为渗透压皱缩很多,细胞核比例增大的原因是细胞没贴附好,要观察你固定前的细胞状态才知道变圆是一开始就造成还是後续步骤的影响 另外在使用mitotracker时用PBS wash的步骤是多余的,直接换成含mitotracker的培养基就可以,我们lab使用的经验是超过30分钟就会出现染剂沉积,染15分钟左右即可 Mitotracker染得好不好可以先在萤光显微镜下面检查,太淡可以加时间,太深赶快拿起来 : 2. 固定细胞 : 以medium 混好的3.7% Paraformaldehyde 固定细胞 15 min 後wash PBS 两次 这里有问题,PFA固定液主要作用在蛋白质的氨基,先不论medium是否有血清,medium的成分已经有胺基酸,肯定会破坏固定液的效果,後续会飘起来的原因应该是这个 一般在没有coating的玻片上操作,固定的步骤就会让很多细胞掉下来,有coating的话就会改善很多,细胞形状也较佳 固定完以後除非去刮或是直接冲洗玻片才有可能让细胞掉下来,照理来讲这步之後就不用太小心加试剂,如果细胞还是有飘的状况大多是固定出问题 : 3. 细胞打洞 : 配置pernibilization buffer : 0.25% Triton X-100 加入Well内5 min : 4. Blocking : 配置blocking buffer 1% BSA，以最低rpm於常温摇晃1小时， : 再用PBS buffer wash 3次 : 5. 加入1o Ab (1:250) 作用O/N 隔天用PBS wash 2次 : 6. 加入2o Ab Goat anti-rabbit 488 (1:250) : 以最低rpm摇1小时，再用PBS wash 2次 : 7. 取出玻片滴上含有DAPI封片胶後盖於载玻片上周围涂上指甲油固定封片 : 然後使用Confocal (ZEISS LSM700) 拍的 : 我有乖乖做Z-stack QAQ... Z-stack并不是必须的,除非你要叠图或是靠叠图增加讯号,不然单层照片理论上就足够说明蛋白质的位置啦,Z-stack照一张要8-10min,单层的只要几秒钟而已XD : 每次做到加triton时细胞都给我飘起来说hello.. : (改0.1%也是) : 我已经非常非常非常小心的加任何试剂了QQ… : 我要怎麽做出细胞贴的好好，然後mitochondira均匀分布的美图咧QAQ : 大大们可以帮小妹做个检讨吗TAT Permeable跟抗体反应你的图都有讯号,所以条件可能OK 只是我有几个疑问 配制溶液的基底都是PBS吧? Permeable到blocking中间没有洗吗? blocking到1抗又为什麽要洗呢? 前者是从有detergent换到无detergent的环境应该要洗一下,後者都是用1% BSA in PBS反应,应该不用洗啦 另外抗体之间洗的时间以我的经验来讲不太够,我基本都是10min x 3次,二抗以後甚至会洗到10min x 5次, 你有没有做Non-primary antibody control确认背景讯号? 判断洗得够不够可以在二抗洗过几轮以後去照萤光观察讯号 最後则是封片时有没有吸乾封片液後再封指甲油? 这可能影响到片子的解析度喔 回答得有点不通顺请多包涵 : 以下图档: : 红色：Mitotracker : 绿色：目标protein : 蓝色：DAPI : http://i.imgur.com/zDygmBc.jpg : 谢谢!!!!!!!! : ----- : Sent from JPTT on my Samsung SM-J700F. --

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