作者Cappello (帽子)
看板Biotech
标题[求救] 关於16s rDNA的qPCR问题
时间Sun Mar 10 13:01:43 2019
目前是研究生
老板要我做不同采样方法得到的菌量差异
但本身对分生方面很陌生
他的意思是采样完後抽dna跑qPCR
（我是参考paper上使用16s rRNA primer去夹）
看Ct值去比较菌量多寡
我一直觉得这方法有很多疑点
(姑且先不论dna的萃取效率)
但是老板却叫我照他说的做就对了
身边也没有专人能提点
所以想想请问板上的专家
这样是真的可行的吗
後来是有开始做qPCR的实验
(使用sybr的mixer)
结果发现连作为blank的水Ct值都有30左右
因为采样的菌量相当之少
我的样品则在26之间浮动
使用的水有过0.22膜也灭过菌了
耗材也是用完就丢
想请问是环境污染所致吗
也有考虑到mixer本身就有dna的残留问题
想请问有没有能够改善的方法
感谢各位拨冗阅读
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1F：→ blence: 好奇想知道你对於qPCR用来推测菌量的疑点是什麽？ 03/10 14:11
因为之前有看到好像不同细菌他们的16s rRNA copy数目不同，这样是不是会有误差呢?
另外是不是使用某种菌做标准曲线求总菌数的意义也不大了这样
还有因为是做相对定量，请教一下reference gene要如何选择呢?谢谢
※ 编辑: Cappello (140.112.98.220), 03/10/2019 16:08:25
※ 编辑: Cappello (140.112.98.220), 03/10/2019 22:17:54
※ 编辑: Cappello (140.112.98.220), 03/10/2019 22:18:36
2F：推 as862437: 水控制的那组melting curve 跟 amplify curve 先看有没 03/10 22:59
3F：→ as862437: 有线，可以知道是不是真的有16s片段在里面或是杂讯 03/10 22:59
4F：→ as862437: 同一批操作DNA萃取萃取效率应该要差不多的，除非你样本 03/10 23:00
5F：→ as862437: 条件差很多 03/10 23:00
6F：推 as862437: 16s rDNA定量菌数的文章满多的了方法应该是确立的 03/10 23:02
水的话amplify curve是有线的，melting curve比较奇怪一点，我做三重复，但每组里面都会有一个出现两个峰，另外三重复的CT值很不稳定，常常在35-29之间跳，我每次都有做一组E coli当作positive control，他的melting curve和Ct值都很稳定，所以现在不太清楚到底是污染还是我操作手法有问题，另外我查资料似乎都是使用16s rRNA作为control去定某个特定菌的菌量，关於这部分我可能还要再找找，谢谢A大
7F：推 Ianthegood: 经验中 水有讯号通常是污染 03/11 16:53
8F：推 Ianthegood: 你的疑虑的确有重要性 但是以实用性考量现在还是以qPC 03/11 16:56
9F：→ Ianthegood: R为主流 毕竟没人有钱到什麽都打sequencing 03/11 16:56
後来有用分子生物等级的水做过，一样是有讯号的QQ 所以照I大的意思是还是可以用Ct值去判断采样手法菌量的多寡吗?谢谢!
※ 编辑: Cappello (140.112.98.220), 03/11/2019 20:57:22
※ 编辑: Cappello (140.112.98.220), 03/11/2019 20:58:34
10F：→ fallensam: 我之前也有用这个方法测菌量sample的melting curve 通 03/12 10:56
11F：→ fallensam: 常是同一个peak有多个表示污染了 03/12 10:56
13F：→ fallensam: com/0YJwnMt.jpg 03/12 10:56
回F大，所以纯水会有Ct是必然的罗?我後来试了很多组primer，有些melting curve的peak就是会有很多个，如图
https://imgur.com/GzB2ziN，不知道是不是dimer的生成还是污染之类的，谢谢你的回答!
14F：推 Ianthegood: 回原po 对 Ct是ok的 然後楼上+1 通常水有讯号都是自己 03/13 19:09
15F：→ Ianthegood: 手残cross contaminate到 03/13 19:09
16F：→ Ianthegood: 然後不只要看peak还要看强度 有时候只是noise 03/13 19:10
回I大，像这图
https://imgur.com/jjr6ePl绿色是水，蓝色是E coli，其实peak差不多强，可能真的是我手法的问题吧QQ，谢谢!
17F：→ milulittle: 是否有试过别的厂牌的mastermix? 或许可要一些试用品 03/15 00:12
18F：→ milulittle: 看看 03/15 00:12
回m大，有喔，试了4 5 家的试剂了，P水都会有讯号
※ 编辑: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 13:58:29
※ 编辑: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 13:59:46
在这里回覆一下，後来有看到几篇paper，都有提到关於qPCR reagent污染的问题，所以用16s rRNA universal primer p水出现Ct值可能真的是无法避免的，後来我有再试了几组primer，找到了melting curve出来peak比较乾净的primer了，没意外的话应该就会继续做下去了，谢谢版上各位前辈提供的经验!
※ 编辑: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 14:06:50
※ 编辑: Cappello (140.112.98.220), 03/21/2019 14:07:40